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目的:从整体动物实验和体外细胞实验两个层面,探讨中药双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)大鼠新生血管的抑制作用及对内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)的增殖抑制作用,并以VEGF/KDR环路为切入点,阐述双丹明目胶囊发挥作用的具体机制,为DR的发病机制研究及中医药防治提供实验依据。方法:1.取人脐带血原代分离EPCs,采用其特异性抗原CD34进行鉴定,传代消化后分为8组:对照组、空白血清组、双丹明目胶囊含药血清组(共5组:11.2mg/ml、2.24 mg/ml、1.12 mg/ml、0.56 mg/ml、0.28 mg/ml)、导升明含药血清组,药物分别干预24 h和48 h后,MTT法检测细胞增殖抑制率,摸索双丹明目胶囊的最佳给药浓度及干预时间;确定给药浓度及干预时间后,将EPCs分为5组:空白血清组、双丹明目胶囊含药血清组、导升明含药血清组、VEGF/KDRSU1498阻断剂组、双丹明目胶囊含药血清+VEGF/KDRSU1498阻断剂组,采用Elisa法检测细胞上清液中VEGF含量,Western-blotting和RT-PCR法分别检测VEGF/KDR环路及其下游因子Ras、Raf-1、MEK、ERK蛋白及基因的表达情况。2.68只SD大鼠随机分为2组,一组10只为正常对照组,另一组58只为造模组,采用一次性腹腔注射STZ(50 mg/kg)的方法诱导糖尿病模型,并随机分为模型组、导升明组、双丹明目胶囊高、中、低剂量组,每组11只。造模后一周开始灌胃给药,持续12周,末次给药结束后,测定大鼠空腹血糖值并进行眼底荧光血管造影。采用试剂盒法检测血脂四项及血液流变学指标,HE染色法检测视网膜病变程度,Elisa法检测血浆VEGF含量,免疫荧光双标法观察视网膜VEGF阳性细胞数,Western-blotting法检测视网膜VEGF/KDR及其上游因子Spred-1、HIF-1α、NF-κB蛋白表达情况。结果:1.经CD133、CD34、KDR标记鉴定为EPCs;与空白血清组比较,双丹明目胶囊含药血清有明显的抑制EPCs增殖作用,且呈一定程度的剂量依赖性,但干预48 h和干预24 h差别不大,综合分析以1.12 mg/ml、24 h为最佳的含药血清干预浓度及时间。2.与空白血清组比较,双丹明目胶囊含药血清组细胞上清液中VEGF含量显著下降,VEGF、KDR表达下调,其下游调控因子Ras、Raf-1、MEK、ERK蛋白和基因表达均显著下调,在联合VEGF/KDR环路特异性阻断剂后,上述指标表达均在双丹明目胶囊血清单独干预基础上进一步下降,表现出良好的协同增效作用。3.与对照组比较,DR模型组大鼠血糖异常升高,血脂及血液流变紊乱,视网膜微血管增多、毛细血管扩张、网状结构疏松、间质水肿,血浆VEGF含量增加,视网膜VEGF阳性细胞增殖显著,VEGF、KDR蛋白表达上调,其上游促血管生成相关因子HIF-1α、NF-κB表达增加,而抑制血管生成相关因子Spred-1表达减少。4.给予双丹明目胶囊干预后,DR模型大鼠高血糖情况得到一定控制,血脂和血液流变紊乱状态得以改善,同时,视网膜病变情况得到缓解,微血管数量下降,视网膜各层次结构清晰,水肿减轻;血浆VEGF含量有明显下降,视网膜VEGF阳性细胞数减少,其增殖受到抑制,VEGF、KDR、HIF-1α、NF-κB蛋白表达较模型组有显著下调,同时Spred-1表达上调。结论:综上,本研究通过从体外细胞实验和体内动物实验两方面综合研究发现,双丹明目胶囊具有良好的降糖降脂、抑制微血管生成、缓解视网膜损伤、抑制内皮祖细胞增殖等作用,该作用是通过抑制VEGF/KDR环路而降低VEGF合成,并调控该环路上下游因子而实现的。