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研究背景:肾脏纤维化是肾脏衰老以及慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的共有组织病理改变,是肾脏受到持续不断有害刺激过度修复的结果,以肾实质细胞向肌成纤维母细胞转分化（Myofibroblast trans-differentiation,MTD）为特征。肾细胞包括肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和单核吞噬细胞受损后失去其自身表型并转分化为肌成纤维母细胞,产生和分泌大量不易降解的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）蛋白沉积在肾脏间质,并逐渐破坏肾脏的组织结构和功能。在分子水平,肾脏纤维化可以被多种促纤维化信号通路（TGFβ/Smad、Wnt/β-catenin）和抗纤维化因子（Klotho、RASAL1和BMP-7）所调控。最近的研究表明,这些纤维化相关基因可以受到表观遗传修饰的调控,从而影响肾纤维化进程。其中,多种广谱和家族选择性组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）的抑制剂在不同动物模型中均表现出抗纤维化特性,表明异常上调的HDAC控制着肾脏纤维化的发生发展。在哺乳动物中,HDAC根据其结构、亚细胞分布和酶学特征分为四大家族:Class I（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）、Class IIa（HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9）、Class IIb（HDAC6和HDAC10）、Class III（Sirt1–7）和Class IV（HDAC11）。HDAC主要通过去除组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基从而恢复染色质上正电荷,使核小体固缩导致基因的转录抑制。值得注意的是,Class I HDACs通常与转录因子形成转录抑制复合物,并主动抑制基因转录,而且Class I HDACs特异性抑制剂可以改善肾脏纤维化相关蛋白表达并缓解肾脏纤维化损伤,说明Class I HDACs是主要的促肾脏纤维化亚类,但具体致纤维化亚型及作用靶点还不确定。肾纤维化相关蛋白如促纤维化生长因子、ECM蛋白和抗纤维化分子都可以受到HDAC调控,其中ECM蛋白在纤维化肾脏中上调,似乎与HDAC的抑制作用相反。研究表明,抗纤维化蛋白Klotho的水平在几乎所有的肾脏纤维化相关疾病患者和动物模型中都受到抑制;过表达内源性Klotho以及外源性补充Klotho都能够缓解动物模型中的肾纤维化病理过程,改善肾脏功能。此外,Klotho在肾脏疾病时的下调能被HDAC抑制剂逆转,提示Klotho是HDAC异常修饰的关键效应蛋白。据此,我们推测由于HDAC异常高表达导致的Klotho表观遗传性缺失可能参与肾脏纤维化的发病或进展。研究目的:本课题以单侧输尿管结扎（Unilateral ureter obstruction,UUO）以及马兜铃酸肾病（Aristolochic acid nephropathy,AAN）诱导的肾脏纤维化模型为研究对象,从以下几个方面确定致肾脏纤维化的HDAC主要亚型以及其对Klotho的表观遗传调控对肾脏纤维化的作用,并探索HDAC抑制剂能否通过逆转Klotho缺失来缓解肾脏纤维化。研究方法:1)构建UUO诱导的肾脏纤维化模型来确定I类HDAC（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）的m RNA和蛋白的变化,并通过肾脏切片免疫组化和免疫荧光染色,确定上调的HDAC3的表达部位。2)HDAC3启动子含有Smad结合位点。通过体内给予UUO小鼠TGFβ受体抑制剂、体外给予TGFβ刺激的细胞Smad3磷酸化抑制剂,以及通过构建HDAC3启动子报告质粒,探究肾纤维化中HDAC3的上调机制。3)构建HDAC3基因敲除小鼠和UUO以及AAN诱导的肾脏纤维化模型,并给予HDAC3特异性抑制剂RGFP966处理,观察不同组别中肾脏损伤及Klotho表达量的变化。4)细胞中过表达HDAC3或给予RGFP966处理,观察HDAC3及Klotho表达的变化,并构建Klotho启动子报告质粒,探究HDAC3对Klotho的转录调控作用。5)通过蛋白质免疫沉淀以及染色质免疫沉淀实验,确定在纤维化肾脏中HDAC3调控Klotho的具体作用方式及作用位点。6)通过小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）体内敲减Klotho的方法,比较RGFP966对si RNA-Control和si RNA-Klotho小鼠肾脏纤维化改善程度的差异,来探究Klotho是否是HDAC3促肾脏纤维化及RGFP966抗肾脏纤维化作用的关键介导蛋白。研究结果:1)HDAC3基因敲除小鼠抵抗UUO诱导的肾脏纤维化,说明HDAC3是重要的致肾脏纤维化的HDAC亚型。2)在纤维化肾脏和肾小管纤维化模型中,HDAC3的异常高表达能够分别被TGFβ受体抑制剂和Smad3磷酸化拮抗剂抑制,因此TGFβ/Smad3信号通路是HDAC3异常上调的直接上游诱因。3)HDAC3特异性抑制剂RGFP966可以缓解UUO和AAN模型小鼠肾脏的Klotho下调、肾脏纤维化相关蛋白异常表达和肾脏纤维化损伤,说明抑制HDAC3可能通过逆转Klotho下调发挥抗肾脏纤维化作用。4)HDAC3是Klotho上游调控蛋白,HDAC3与转录因子NF-κB和NCo R结合形成转录抑制复合物作用于Klotho启动子NF-κB结合位点而发挥转录抑制作用。5)HDAC3选择性抑制剂RGFP966可以显著改善对照UUO小鼠的肾脏纤维化损伤,但Klotho敲减后,其抗肾脏纤维化作用明显消失,表明Klotho是介导HDAC3异常致肾脏纤维化和RGFP966抗肾脏纤维化的关键靶点。结论:虽然目前大量研究表明HDAC的异常活化与肾脏纤维化发生发展有密切的关系,但是关键的致纤维化HDAC亚型、作用靶点及调控机制并不明确。我们的研究表明,纤维化肾脏中受TGFβ影响异常上调的HDAC3导致Klotho缺失促进了肾脏纤维化的发生发展;HDAC3抑制剂可以逆转Klotho缺失,并Klotho依赖性缓解纤维化肾脏损伤。我们的研究结果不仅揭示了肾脏纤维化中重要的表观遗传调控通路,而且还为临床治疗肾脏纤维化相关疾病提供了更多策略。