链霉菌拥有丰富的初级代谢途径和强大的次级代谢能力,它的次级代谢产物是小分子药物的重要来源,链霉菌的次级代谢产物的生物合成受到很多复杂的调控,研究其调控的分子机制,可以为理性提高次级代谢产物的产量提供理论依据,也可为指导发现新的有价值的代谢产物。本研究论文主要包括两部分内容,一部分是建立了一种快速、准确的链霉菌胞内代谢物的分析方法：以模式菌株天蓝色链霉菌为研究对象,基于GC-MS分析平台优化了代谢组学样品制备流程中的细胞淬灭时间、菌体分离方法、代谢物提取及代谢物衍生化条件,并利用该方法对天蓝色链霉菌不同生长时期各代谢物的相对活性进行了初步分析。采用“低温淬灭(-40℃,4min)-快速过滤分离-反复冻融(45s/3min)-衍生化(40℃,90min)”的流程能够鉴定出中心代谢途径(糖酵解、戊糖磷酸途径和TCA循环)、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、核酸代谢途径及部分次级代谢途径中的103种主要代谢物。利用该流程测定发现天蓝色链霉菌细胞生长周期中存在显著的代谢时序差异,并且发现氨基酸与脂肪酸代谢在衔接初级代谢与次级代谢生物合成中具有重要作用。本研究建立的测定方法能够有效地用于天蓝色链霉胞内代谢分析,该方法将有助于深入刻画链霉菌细胞代谢过程,为菌株代谢工程改造增加次级代谢产物产量提供理性指导。第二部分工作是土霉素合成调控蛋白OtrR及其与土霉素相互作用关系的研究。很多微生物能够产生具有抗生素活性的分子,使之在与外界其他微生物共存时具有竞争优势,但是这些抗生素小分子积累至一定浓度时往往对自身也产生毒害作用,因此要利用外排系统将合成的这些次级代谢产物运出体外。其中比较有代表性的是TetR-tetA外排系统,TetR调控蛋白通过N端DNA结合结构域直接结合靶DNA,抑制外排基因tetA的转录,当自身产生的抗生素类小分子达到一定浓度时,可以与TetR蛋白C端配体的结合结构域结合,导致蛋白构象发生改变,使其从靶DNA上解离下来,从而能够解除对靶基因外排泵基因的转录抑制,使抗生素小分子泵出体外,这样的系统我们称之为“TetR调控蛋白-抗性基因”系统。本工作的研究对象是龟裂链霉菌的土霉素合成基因簇中的调控基因OtrR与外排泵基因otrB。这两个基因反向转录,与产金霉素的金色链霉菌的CtcS-ctcR和大肠杆菌的TetR-tetA排布相同。途径特异性调控蛋白与外排泵基因在基因组上毗邻,而且反向转录,我们推测其外排泵基因可能也受其调控蛋白的直接抑制。OtrR是MarR家族的蛋白,通常以二聚体形式存在直接与DNA结合,很多MarR蛋白是抑制蛋白,小分子通过有活性的半胱氨酸残基可与MarR结合将蛋白从DNA上解离下来。首先我们对OtrR进行了异源表达和纯化,得到了纯度较高的带有His标签的重组蛋白,然后通过体外EMSA实验证实OtrR不仅与自身启动子PotrR-otrB结合,也能与金色链霉菌抗性调节蛋白CtcR启动子PctcR-ctcS结合。因此,我们推测PotrR-otrB和PctcR-ctcS中可能存在相对保守的结合序列。通过序列同源性比对得到PotrR-otrB和PctcR-ctcS共同存在的14bp的发夹结构,初步推测P14bp可能是OtrR结合的靶序列。体外EMSA实验与SPR实验均证明这段序列可与OtrR结合,且SPR实验得到OtrR与结合的靶序列的亲和力为0.14nM。SPR实验结果亦表明OtrR能够与自身产生的抗生素土霉素素结合。我们通过实验证明,除土霉素外,四环素类抗生素,四环素,强力霉素,金霉素都能解除OtrR对自身的抑制。这也印证了我们之前的猜想,OtrR-otrB行使着“TetR-tetA调控蛋白-抗性基因”的功能。