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肝脏是人体内最大的实质器官,其结构和功能复杂,也是外源性物质及其代谢产物攻击的主要靶器官。机体短期接触较大剂量外源性物质可引起急性肝损伤(acute liver injury,ALI),在外来因素长期作用下,如果不能完全修复,可发展成慢性肝损伤。肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是各种慢性肝损伤的共有病理变化,其持续发展为肝硬化可引起肝功能衰竭甚至肝细胞癌,使得肝脏疾病成为人类发病和死亡的常见原因之一。已知多种致病原因可导致肝损伤,如病毒性肝炎、酒精性肝炎和药物性肝炎等。但目前肝损伤的发病机制尚未完全阐明,仍未发现十分确定、特效的药物,因此,深入研究肝损伤的发病机制,为临床寻找理想的抗肝损伤药物,尤其是抗纤维化的药物,具有重要的理论和临床意义。归芍颗粒(Guishao particle,GP)来源于陈士铎的《石室秘录》,此方通过疏柔并济法治疗肝病。GP由当归、白芍、栀子、甘草和金银花组成,其中君药当归的主要成分是阿魏酸和当归多糖,臣药白芍的主要成分是白芍总苷。课题组前期研究表明白芍总苷与当归提取物合用对四氯化碳carbon tetrachloride,CCl4)和D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)诱导的化学性肝损伤和卡介苗联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的免疫性肝损伤均具有保护作用,同时可抑制肝细胞凋亡。因此,我们设想GP可能具有保护肝损伤的作用,值得进一步探讨。本研究以大鼠ALI模型和大鼠HF模型为研究对象,观察大鼠病理指标、生化指标、凋亡指标和凋亡相关蛋白在模型大鼠肝组织中的表达以及GP对大鼠ALI和HF的保护作用；同时探讨了GP对凋亡通路的调节和机制。目的：1利用D-GalN联合LPS给药诱导大鼠ALI模型,观察ALI大鼠病理指标、凋亡指标以及凋亡相关蛋白在模型大鼠肝组织中的表达,明确GP对大鼠ALI的保护作用及其部分机制。2利用CCl4诱导大鼠HF模型,观察HF大鼠病理指标、生化指标以及α-SMA在HF大鼠肝组织中的表达,明确GP对大鼠HF的保护作用及其部分机制。方法：1 SD大鼠腹腔注射D-GalN(50mg·ml-1)联合LPS(0.48μg·ml-1)建立大鼠ALI模型。造模成功后,将大鼠随机分为6个组别：正常组,模型组,GP(3.5g·kg-1,7g·kg-1, 14g·kg-1)治疗组,联苯双酯(Bifendate Pills,BP)(200mg·kg)阳性对照组,n=12。光镜下观察肝组织病理学变化,电镜下观察肝细胞的形态及结构；流式细胞仪(Flow cytometric method,FCM)检测肝细胞凋亡及对线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,MTP);免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、B细胞淋巴瘤／白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma 2,Bcl-2)蛋白的表达情况；酶标仪检测天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的活性；免疫印迹法(Western blot,WB)检测肝细胞胞质及线粒体内细胞色C(cytochrome C,Cyt C)的表达水平；逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)法检测肝脏中C/EBP同源蛋白质(C/EBP homologous protein, CHOP) mRNA的表达水平。2 SD大鼠背部皮下注射50% CCl4(灭菌橄榄油1：1稀释),1 ml·kg-1,每周2次制备HF模型。造模成功后,大鼠随机分为6组(n=15)：正常组、模型组、GP(3.5g·kg-1,7.0g·kg-1,14g·kg-1)治疗组和秋水仙碱(colchicine,Col) 0.1 mg·kg-1阳性对照组。测定大鼠肝脏指数；取部分肝组织做苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)和Masson染色；取大鼠腹主动脉血检测血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)的活性水平；放射免疫法检测大鼠血清中透明质酸(hyaluronic acid, HA)和层粘连蛋白(laminin, LN)的水平；酶标仪法检测大鼠肝组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,HyP)的含量；IHC法检测肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)的表达水平。结果：1 GP对D-GalN联合LPS诱导大鼠ALI的作用1.1 ALI大鼠病理指标、凋亡指标以及凋亡相关蛋白在ALI大鼠肝组织中的表达与正常组相比,光镜下发现,ALI大鼠的肝脏病理变化明显,肝损伤严重；电镜下发现,肝细胞变性坏死且超微结构下可见凋亡小体；FCM检测发现,ALI大鼠肝细胞凋亡率明显升高,肝细胞线粒体膜电位显著下降；酶标仪检测发现,ALI大鼠肝组织中caspase 3活性明显升高；ICH检测发现,ALI大鼠肝组织中Bax、Bcl-2表达水平明显升高；WB检测发现,ALI大鼠肝细胞胞质内的Cyt C表达水平明显升高,而线粒体内Cyt C表达水平明显降低；RT-PCR检测发现,ALI大鼠肝组织中CHOP mRNA表达水平明显升高。1.2 GP对ALI大鼠肝组织病理学的影响与模型组比较,GP组大鼠肝组织的炎性细胞浸润和肝细胞坏死明显减少,偶见凋亡细胞,肝组织的损伤修复程度较好；肝细胞的形态较为正常,肝细胞核呈圆形排列而且胞内线粒体并无肿胀的现象,但是肝细胞内的滑面内质网却明显增多并出现了大小不等的脂滴。1.3 GP对ALI大鼠凋亡指标的影响与模型组比较,GP明显降低ALI大鼠肝细胞凋亡率,显著升高肝细胞线粒体膜电位；明显降低ALI大鼠肝组织中caspase-3的活性。1.4 GP对ALI大鼠肝组织中凋亡相关蛋白表达水平的影响与模型组比较,GP显著升高ALI大鼠肝组织中Bcl-2的表达水平：显著下调ALI大鼠肝细胞胞质内Cyt C的表达水平,明显上调ALI大鼠肝细胞线粒体内CytC的表达水平；明显下调ALI大鼠肝组织CHOP mRNA的表达水平。2 GP对CCl4诱导大鼠HF的作用2.1 HF大鼠病理指标、生化指标以及α-SMA在HF大鼠肝组织中的表达与正常组比较,HE和Masson染色发现,HF大鼠肝小叶结构破坏,汇管区伸出粗大的胶原纤维条索分割、包绕肝小叶而形成假小叶,肝细胞发生脂肪变性、坏死、胶原沉积以及炎性细胞浸润；评分发现,HF大鼠纤维化程度明显增强；生化检测发现,HF大鼠血清中ALT、AST、HA、LN的含量明显升高；酶标仪检测发现,HF大鼠肝组织中HyP含量明显升高；ICH检测发现,HF大鼠肝组织a-SMA表达水平明显升高。2.2 GP对HF大鼠肝组织病理学的影响与模型组比较,GP明显改善HF大鼠肝组织形态和结构,只有少量的不完整假小叶形成、少量的胶原沉积和炎性细胞浸润；显著降低HF大鼠肝纤维化程度,明显减少HF大鼠肝脏胶原的沉积。2.3 GP对HF大鼠生化指标的影响与模型组比较,GP显著降低HF大鼠的肝脏指数；明显降低HF大鼠血清中ALT、AST、HA和LN的水平；明显降低HF大鼠肝组织中HyP的含量。2.4 GP对HF大鼠肝组织中α-SMA表达的影响与模型组比较,GP明显降低HF大鼠肝脏中α-SMA的表达水平。结论：1.GP改善ALI大鼠病理损伤,抑制肝细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的表达,可能是其发挥保护作用的机制之一。2.GP改善HF大鼠病理损伤,减少胶原沉积,降低生化指标以及抑制α-SMA的表达,可能是其发挥保护作用的机制之一。