登革病毒(denguevirus，DV)是黄病毒属的单股正链RNA病毒，分为四个血清型(DV1～4)。DV主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，每种血清型都可引起人类登革热(classicaldenguefever，DF)和登革出血热/登革休克综合征(denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome，DHF/DSS)。近年来，随着旅游业的发展和地球温暖化，DF和DHF/DSS流行、暴发越来越频繁。DHF/DSS患者病死率高，发病机制不清。 较多的临床研究显示肝细胞是DV的重要靶细胞之一，肝损害在DHF/DSS发病过程中占有重要地位： 1)肝组织中可以检测到DV抗原，并能分离到具有感染性的病毒； 2)DV还可以感染体外培养的HepG2，HuH-7，HA22T，Hep3B，PLC等人类肝癌细胞株，培养上清中也可检测到成熟的病毒颗粒； 3)DHF/DSS病人常常出现肝肿大，尸检可见肝组织脂肪变性，枯否氏细胞肥大等。血清转氨酶水平升高，凝血酶含量下降，其幅度变化与肝损害程度及出血、休克的发生密切相关。据文献报道，DV可以直接感染肝细胞，引起肝脏损伤，换言之，肝脏可能是DV重要的靶器官之一。然而，在过去相当长的时间里，学者们对DV感染后凝血系统、血管内皮细胞及炎症因子变化做了较多的研究，与之相比，肝细胞损伤机制所受关注较少，如能发现病毒复制对肝细胞哪些方面产生了影响，找到宿主细胞参与病毒复制的关键分子，不仅对DV感染机制的阐明有重要意义，同时也为进一步研究抗病毒药物奠定重要的基础。 本研究主要结果与结论如下： 1.DV2感染对HepG2细胞内外GSH水平的影响 感染组加入DV2以MOI=10感染HepG2细胞，模拟感染组则加入56℃灭活30min的病毒液，同等条件置于37℃，以感染起始记为O时，在感染10min、20min、30min、40min、60min/1h、2h、6h、12h、24h、48h(后5个时相点吸附后1h，更换病毒维持液)时，分别用PBS充分洗涤细胞，胰蛋白酶消化，取出细胞。经过四次快速冻融，离心取上清用于GSH的测定。取相同数量的细胞经超声裂解用于测定细胞蛋白浓度。结果发现，病毒感染后10min、20min、30min、40min、60min/1h，HepG2细胞内GSH水平与模拟感染组比较，呈下降趋势，其中以30min下降最为明显，为16.82±0.86nmol/mg(n=5)，与模拟感染组23.14±1.41nmol/mg(n=5)和感染组的其他时相点比较均有显著差异(P＜0.01)。病毒感染后2h、6h、12h、24h、48h，HepG2细胞内GSH水平与模拟感染组比较，仍呈下降趋势，其中以2h，24h时下降较为明显，分别为29.51±3.16nmol/mg(n=5)和17.75±3.32nmol/mg(n=5)，与相应时相点的模拟感染组35.45±3.55nmol/mg(n=5)和22.91±4.15nmol/mg(n=5)以及感染组的其它时相点比较，差异显著(P＜0.05)，其后逐渐恢复，到48h时已与模拟感染组无显著差异(P＞0.05)。 感染后30min上清中的GSH含量为47.86±3.00nmol/ml(n=4)，较模拟感染组升高33.09％，且有显著差异(P＜0.05)，而模拟感染组与病毒原液则无显著差异(P＞0.05)。以上结果说明DV2感染能够使HepG2细胞内GSH水平下降，改变宿主细胞的氧化还原状态，且呈现阶段性变化，推测可能与病毒的复制过程有关。结合感染后同一时相点细胞外GSH水平的升高和文献报道，推测DV2感染后30min细胞内GSH水平的快速降低可能是由于DV2感染所致细胞膜通透性增加、GSH的外漏引起的。 2.DV2E蛋白对宿主细胞内外GSH水平的影响 首先构建了稳定表达E蛋白的HepG2细胞株pRe-E/HepG2，并且通过PCR、酶切、核苷酸测序及间接免疫荧光法进行了鉴定和检测，确认了该细胞中E蛋白的表达。同时构建了稳定转染空质粒的细胞株pRe-E/HepG2作为对照。 然后测定了pRe-E/HepG2细胞内外GSH的水平。结果：pRe-E/HepG2细胞内GSH水平与pRe/HepG2细胞对照组比较，呈下降趋势。pRe-E/HepG2细胞内GSH平均浓度为25.61±2.23nmol/mg(n=4)，pRe/HepG2细胞内的GSH平均浓度为33.38±1.07nmol/mg(n=4)，与pRe/HepG2细胞比较，pRe.E/HepG2细胞内GSH下降了24.3％(P＜0.01)。取对数生长期pRe-E/HepG2和pRe/HepG2细胞的培养上清0.5ml测定GSH浓度，发现pRe-E/HepG2细胞上清中GSH含量平均值为36.72±1.40nmol/ml(n4)，pRe/HepG2细胞上清中GSH含量平均为57.41±2.00nmol/ml(n=4)，前者相较后者明显降低，两者差异显著(P＜0.05)，前者较后者平均下降了36.35％。以上结果表明，稳定表达E蛋白的pRe-E/HepG2细胞较稳定转染空质粒的pRe/HepG2细胞，细胞内外GSH浓度均下降显著，提示E蛋白在宿主细胞中的表达不仅可以改变细胞内的氧化还原状态，还可以使宿主细胞外的GSH水平降低，在DV2感染诱使的细胞氧化还原状态变化的过程中，E蛋白可能起重要作用。 3.BSO及外源性GSH处理对DV2感染的影响 依据MTT实验结果并参照文献，选择BSO的处理浓度为0.2mM和1mM，外源性GSH的处理浓度为10mM和20mM。 在不感染病毒的情况下，培养上清中加入0.2mM、1mMBSO处理18h，可使细胞内GSH含量由空白对照组的24.53±2.59nmol/mg(n=5)分别下降至14.29±1.48nmol/mg(n=5)、14.05±1.93nmol/mg(n=5)(P＜0.05)，且两种浓度下降幅度无显著差异(P＞0.05)，幅度平均为42.24％(n=5)。在DV2感染+BSO处理组，感染前18h分别用0.2mM、1mMBSO预处理HepG2细胞，然后用DV2以MoI=1感染HepG2细胞，并维持BSO浓度至感染24h，空白对照组不加药物处理。感染后24h收取病毒上清，噬斑试验测定病毒滴度(PFU/ml)。结果发现0.2mM与1mMBSO处理组病毒滴度较空白对照组分别上升了119.79％(n=5)和127.51％(n=5)，与空白对照组比较差别显著(P＜0.05)，但两种浓度BSO处理组的病毒滴度上升幅度无显著差异(P＞0.05)。 在不感染病毒的情况下，培养上清中加入10mM、20mMGSH溶液与空白对照组相比，细胞内GSH含量均无显著差异(P＞0.05)；在DV2感染+GSH处理组，从感染起始到感染24h维持上清内GSH浓度分别为10mM、20mM，空白对照组不加药物处理。感染后24h收取病毒上清，测定病毒滴度(PFU/ml)。结果发现较空白对照组而言，10mM与20mMGSH处理组病毒滴度分别下降40.24％(n=5)和56.62％(n=5)，两种浓度GSH处理组均与空白对照组差异显著(P＜0.05)，且20mMGSH处理组病毒滴度下降更为明显(P＜0.05)；以上结果说明不仅DV2可以引起细胞内的氧化还原状态改变，细胞内的氧化还原状态反过来也可以影响DV2的复制和增殖。 以上结果为阐明DV的致病机理和进一步设计靶向抗病毒药物提供了初步的实验依据。