Src酪氨酸激酶家族(Src-family kinases，SFK)包括9个成员，Blk，Fgr，Frk，Fyn，Hck，Lck，Lyn，c-Src，c-Yes。这些非受体酪氨酸激酶为胞质蛋白，在细胞表面蛋白、跨膜蛋白和转录因子之间传递信号。生理状态下他们通过磷酸化一个C-端酪氨酸使它们处于失活状态，而当这个酪氨酸去磷酸化后，分子构象的改变导致激活环中另一个酪氨酸磷酸化，从而使它激活，与其他蛋白发生相互作用。 c-src是最古老的癌基因，是SFK中研究得最多的一个成员，编码分子量为60kD的蛋白c-Src。c-Src在调控细胞的生长(生存和增殖)、粘附、运动等方面发挥重要作用。人类很多肿瘤都存在Src蛋白的过度表达和/或活化，Src活性的增高上调了许多与肿瘤发生、发展相关的信号转导通路，导致了细胞过度增殖、恶性转化、迁移和侵袭。因此，Src作为肿瘤分子遗传学的一个入口显得尤为重要，抑制Src可抑制多个转导通路，使其成为一个有独特潜力的抗肿瘤分子靶点。 宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率位居女性恶性肿瘤的第二位，每年新发病人数达51万，其中约有一半的妇女因之而死亡。在过去的几十年里，发达国家已经成功地运用筛查降低了宫颈癌的发病率和死亡率。但在多数发展中国家，宫颈癌仍然是最主要的妇科恶性肿瘤之一。 近年来，宫颈癌的诊断治疗技术取得了长足的发展，目前手术和放化疗的一线治疗可以治愈80％-95％的早期患者。但局部晚期宫颈癌和复发的宫颈癌仍然缺乏有效的治疗手段，复发的宫颈癌几乎是不可治的，其5年存活率少于5％，因此，需要新的策略来提高这些患者的存活率和生存质量。和其他肿瘤一样，寻找在肿瘤发生发展中引起信号转导和代谢紊乱的特异的分子靶点已成为宫颈癌治疗的新的焦点。 目前为止，对于Src在宫颈癌中表达和活性情况几乎是一无所知，因此，我们假设Src的活化与宫颈癌细胞的增殖有关，通过c-Src siRNA和Src酪氨酸激酶抑制剂PP2抑制Src激酶活性，观察对宫颈癌细胞生长的抑制，以及PP2对人宫颈癌细胞诱导的皮下肿瘤的干预作用，来证明我们的假设。 目的:探讨Src激酶在宫颈癌细胞增殖中的作用。 方法: 1.采用免疫组织化学法检测Src pY416蛋白在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达以及Src酪氨酸激酶抑制剂PP2治疗后裸鼠移植瘤中Src pY416蛋白水平的变化。 2.采用c-Src siRNA干扰的方法下调HeLa和siHa细胞c-Src的表达。 3.采用Real-time RT-PCR法检测c-Src siRNA干扰的效率。 4.采用western blot方法来检测c-Src siRNA和PP2处理后，对HeLa和SiHa细胞c-Src和Src pY416及cyclins、CDKs和CKIs蛋白水平的影响。 5.采用MTT法检测降低Src激酶活性后，对HeLa和SiHa细胞体外增殖的影响。 6.采用流式细胞术分析降低Src激酶活性后，对HeLa和SiHa细胞周期分布的影响。 7.采用雌性BALB/c(nu/nu)裸小鼠，皮下注射宫颈癌HeLa细胞诱导皮下肿瘤动物模型，并皮下注射PP2进行治疗，研究其对移植瘤生长的影响。 结果： 1.免疫组化染色结果显示，正常宫颈组织中Src蛋白呈现弱的自主磷酸化，宫颈癌组织Src蛋白自主磷酸化水平Src pY416明显高于正常宫颈组织，阳性率分别为61.1％和16.7％两组之间有显著差异(P<0.05)。 2.50nM c-Src siRNA干扰24、48和72h后，Real-time RT-PCR法检测HeLa和SiHa细胞c-Src mRNA量明显下降，与正常对照组相比差异显著(P<0.05)。分别下降了31.32％±4.46％、48.57％±5.22％和59.05％±2.335；21.74％±3.61％、47.48％±4.12％和53.13％±1.33％。 干扰48 h后，western blot检测了HeLa和SiHa细胞c-Src蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，分别下降了34.69％±2.85％、28.77％±1.87％，同时Src pY416蛋白水平也显著下降(P<0.05)，分别下降了44.02％±5.34％、41.935±2.46％。c-Src siRNA干扰使HeLa和SiHa细胞生长速度显著减慢，表现出时间依赖性抑制作用，48 h的抑制率(P<0.05)分别为36.61％±1.26％和30.48％±2.15％；72h的抑制率分别为45.61％±4.36％和40.22％±3.45％。 3.Src激酶抑制剂PP2对c-Src自主磷酸化呈现剂量和时间依赖的抑制作用，对c-Src的蛋白水平没有明显的影响。7.5μM和10μM PP2作用48h，HeLa和SiHa细胞Src pY416蛋白水平明显下降，与DMSO组相比差异显著(P<0.05)，HeLa细胞分别下降了15.31％±3.08％和47.155±2.51％；SiHa细胞分别下降了19.94％±2.93％和43.77％±2.06％。10μM PP2作用48和72h，HeLa和SiHa细胞Src pY416蛋白水平明显下降，与DMSO组相比差异显著(P<0.05)，HeLa细胞分别下降了26.95％±3.23％和47.12％±3.99％；SiHa细胞分别分别下降了25.43％±5.15％和52.07％±4.84％。 PP2使HeLa和SiHa细胞生长速度显著减慢，且呈剂量和时间依赖的抑制作用。与DMSO组相比，7.5μM和10μM的PP2作用48 h后，存活细胞数量明显减少，差异显著(P<0.05)。HeLa和SiHa细胞的抑制率分别为17.88％±2.08％和30.22±2.81％；18.96％±1.98％和29.21％±2.45％。作用至72 h，HeLa和SiHa细胞的抑制率分别为33.64％±2.83％和47.32％±6.06％；30.68％±2.9％和45.76％±5.81％。 4.流式细胞计量分析显示，c-Src siRNA和抑制剂PP2下调Src激酶活性后，HeLa细胞阻滞在G0/G1期，SiHa细胞阻滞在G2/M期。c-Src siRNA干扰后HeLa细胞G0/G1期百分率增加到75.72％±2.54％，与正常对照组35.15％±1.75％相比差异显著(P<0.05)；SiHa细胞G2/M期百分率增加到16.51％±0.55％，与正常对照组5.62％±0.67％相比差异显著(P<0.05)。Src激酶抑制PP2作用结果同c-Src siRNA结果相一致。 5.降低Src激酶活性后，HeLa和SiHa细胞cyclins、CDKs和CKIs蛋白水平发生了显著变化。c-Src siRNA干扰48 h后，western blot检测HeLa细胞c-Src、Src pY416、CDK2、CDK4和cyclinA的蛋白水平均显著下降(P<0.05)，分别下降了21.77％±3.595、46.45±5.05％、33.5％±4.58％、30.48％±1.625、44.55％±5.88％5，p27和p21的蛋白水平显著增加(P<0.05)，分别增加了58.02％±1.96％和54.4％±2.04％：SiHa细胞c-Src、Src pY416、CDK2和cyclinB的蛋白水平均显著下降(P<0.05)，分别下降了33.56％±4.75％、49.02％±2.31％、35.025±5.46％、37.645±3.485，p27和p21的蛋白水平显著增加(P<0.05)，分别增加了62.72％±1.18％和88.34％±3.01％。PP1、PP2和PP3除对c-Src蛋白水平无影响外，余同c-Src siRNA转染后结果。 6.人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型成功建立，PP2治疗组的肿瘤体积276±16 mm3明显小于对照组体积592±20 mm3(P<0.05)；免疫组化分析显示PP2治疗组移植瘤中Src pY416水平显著下降，与对照组相比较差异显著(P<0.05)，阳性率为分别为37.5％和100％。 结论： 1.Src在宫颈癌中活性增高可能与宫颈癌的发展相关。 2.降低Src激酶活性，使宫颈癌细胞发生周期阻滞，抑制其体外增殖。 3.Src激酶抑制剂抑制了宫颈癌HeLa细胞的体内增殖。提示Src可能成为宫颈癌治疗的新的分子靶点。