背景:临床肝移植的成功开展,为肝脏疾病的外科治疗开启了新的篇章。目前肝移植已经成为公认的治疗终末期肝病的唯一有效手段,同时也是急性爆发性肝衰竭、肝细胞癌、肝门部胆管癌和一些代谢性疾病的最佳选择。随着手术技术和免疫抑制剂的不断进步,肝移植的手术适应证不断扩大,可能的受益人群也在不断的增加,伴随而来的便是日益凸显的供体短缺问题。虽然活体肝移植、心脏死亡后器官捐献和其他一些边缘供肝的应用可以一定程度上缓解供体短缺带来的压力,然而由于数量有限并且会增加潜在的并发症无法从根本上解决问题。从长远的角度来讲,最实用和有效的解决方法便是异种移植。猪由于其器官大小及生理特点与人类类似并且具有良好的繁殖特性,基因修饰的可行性等优势成为了理想的异种供器官来源。然而相比于非灵长类哺乳动物而言,显然猪与人的亲缘性更远,因此需要更大程度的基因修饰。识别可能获益的遗传表位靶点并辨别其可能的作用对于转基因猪遗传修饰表位的筛选显得至关重要。随着各种转基因猪的不断问世,猪器官异种移植取得了重大进展,异位猪心脏异种移植和肾异种移植分别达到了 945天和435天的生存记录。然而,异种的猪肝脏移植存活时间却仍然无法突破一个月。原因虽然尚不十分明确,但是与凝血功能失调特别是严重的血小板丢失导致的致命出血密切相关。此外,贫血的发生被认为也与肝脏异种移植相关。目前认为异种肝移植后血小板减少的主要原因包含以下两点:(1)猪内皮细胞与灵长类动物的血小板之间的细胞表面受体-配体相互作用不协调;(2)猪肝内皮抗原天然抗体的存在,导致内皮细胞活化。其中,脱唾液酸蛋白受体-1(asialoglycoprotein receptor-1,ASGR1)和 CD11b/CD18(MAC-1)的作用较为明确。同样,猪肝脏的吞噬细胞可以参与人红细胞的吞噬作用。学界普遍认为CD47-信号调节蛋白α(signal regulatory protein-α,SIRPα)信号通路通过识别自我与非我调节吞噬反应,在体外的吞噬实验和体内的细胞移植实验中可介导排斥反应,可能参与了异种肝移植后的血小板减少和贫血的发生,但一直缺乏有力的器官水平的证据。研究目的:通过小鼠肝移植模型及大鼠-小鼠异种肝移植模型,探索CD47-SIRPα不兼容在肝脏移植器官水平对血细胞吞噬作用的影响,从而为转基因猪遗传修饰的表位筛选提供可靠的依据。实验方法:(1)通过完善技术细节和优化非技术细节构建出成熟稳定可靠的小鼠肝移植模型。(2)利用小鼠肝移植模型,探究在同种同基因肝移植后,CD47-SIRPα不兼容对外周血红细胞和血小板计数的影响。并通过免疫荧光染色观察CD41荧光信号的变化以及与F4/80的共定位现象。(3)构建大鼠-小鼠异种肝脏移植模型,通过组织学检查、ALT检测及流式细胞技术,确定其存在排斥反应及产生的排斥反应类型。(4)使用大鼠-小鼠肝脏异种移植模型,探究在异种肝移植后,排斥反应环境下,CD47-SIRPα不兼容对外周血红细胞和血小板计数的影响。并通过流式细胞技术检测血小板活化的情况。结果:(1)通过优化选择小鼠品系及胆道支架,小鼠原位肝移植的远期预后可以达到2周、1个月及3个月100%、80%及80%的生存率。(2)同种同基因肝移植模型后,野生型(wild-type,WT)肝脏移植后,与WT受体小鼠相比,CD47KO小鼠的红细胞计数无明显下降,血小板计数术后第1天(Postoperative day 1,POD1)和POD5有轻度下降。免疫荧光染色共聚焦显微镜观察,CD41荧光信号无明显增加,且与F4/80无共定位现象。(3)选用未脱乳与受体小鼠体重相仿的F344大鼠构建大鼠-小鼠异种肝移植模型,组织学检查和ALT检测证实存在严重的排斥反应。流式检测证实主要的浸润细胞为CD8+T细胞,且T细胞的免疫表型从幼稚的和中枢记忆T细胞向效应型记忆T细胞大量转化。(4)利用大鼠-小鼠异种肝移植模型,F344肝脏移植后,与WT受体小鼠相比,CD47KO小鼠外周血红细胞和血小板的变化并没有显著差异。两组的红细胞、血小板计数均随着时间的推移而不断下降,并且活化的血小板比例无明显变化。结论:(1)小鼠品系和胆道支架的选择制约至小鼠原位肝移植的远期预后。(2)同基因小鼠肝脏移植后,CD47-SIRPα不兼容不能介导肝脏对血细胞的吞噬作用。(3)大鼠-小鼠异种肝移植后产生的排斥反应主要是由CD8+T细胞介导的排斥反应。(4)大鼠-小鼠异种肝移植后,CD47-SIRPα不兼容亦不能介导肝脏对血细胞的吞噬作用。