论文部分内容阅读
黄连素是一种具有广谱抗菌性的药物,由于其大量生产和使用,导致大量含有黄连素的废水排入放到环境中,对生态系统造成极大的威胁。针对黄连素废水生化性差难以生物处理的问题,本研究从黄连素综合废水处理系统的活性污泥中分离、筛选并培养出10支对其具有高效降解能力的细菌菌株,经镜检、理化性质鉴定以及生物学16S rDNA菌种鉴定确定菌株的身份信息。以黄连素为主要目标污染物,分别探究不同菌株对黄连素的降解能力,通过正交试验,确定并构建针对黄连素的高效复合菌群BDCM,并优化降解条件参数,以实现黄连素的高效降解。为深入探索黄连素在BDCM作用下的降解机制和微生物的作用机制,采用了代谢组学和蛋白质组学相结合的方式进行协同研究。本研究得出主要结论如下:从黄连素废水处理系统的活性污泥中分离纯化得到10支细菌,经鉴定确定其分别为:A1:Citrobacter freundii,A2:Bacillus oleronius,A12:Bacillus endophyticus,B1:Stenotrophomonas maltophilia,B2:Bacillus pumilus,B4:Bacillus cereus,B7:Stenotrophomonas sp.,B16:Sphingopyxis macrogoltabida,B17:Ochrobactrum sp.。当黄连素初始浓度在0-20mg·L-1范围内,去除效率最高的单菌株是B16。以黄连素为主要目标污染物构建复合微生物菌群BDCM,BDCM由菌株A2、A3、B1、B4、B16及B17组成,各菌株间比例为1:1:1:1:1:1。在25℃,pH 7,150 rpm,10%的微生物接种量的最佳条件下,BDCM降解初始浓度为40mg·L-1的黄连素溶液。在48 h内,黄连素、TOC的去除率分别达到100%、87%,急性生物毒性从-98%减弱至-2%。黄连素初始浓度在0-80 mg·L-1范围内,BDCM对黄连素的降解过程符合零级反应动力学模型,经Haldane抑制模型拟合,得出Vmax=40.44 mg(g MLSS·h)-1,Km=61.86 mg·L-1,Ki=21.23 mg·L-1,计算结果与实验结果拟合良好。实时荧光定量PCR监测BDCM降解黄连素过程中各菌株的表达量变化,结果显示A2、A3和B4细菌丰度变化较大,其次是B1和B17,B16在降解过程中细菌丰度保持平稳。菌株B17、A3和B4的丰度在降解反应前后呈上升趋势,推断在降解过程中,存在黄连素的某些中间代谢产物促进其生长。菌株A2和B1的丰度在反应前后略有下降,推断其对黄连素的中间代谢产物的利用能力不如前者。成功建立了BDCM对黄连素的代谢组学研究方法。共筛选出288个潜在差异代谢物,检测其为细胞内溶物质、细胞代谢物及部分黄连素代谢产物。确定了代谢物中的4种为黄连素的中间代谢产物,分别为13,13a-二氢-9,10-二甲氧基-2,3-(亚甲二氧基)-甲基吡啶;3-[苯并1,3二氧杂环戊烷]-7,8二甲氧基-6,7,8,9四氢-2(3H)-萘酮;2,3-二甲氧基苯甲醛;3,4-二甲氧基苯甲醛,并由此推测出BDCM作用下的黄连素降解途径。成功建立了BDCM对黄连素的非标记蛋白组学研究方法,解析了蛋白在复合菌群中降解黄连素的表达模式及调控机理。BDCM降解黄连素的蛋白质组学分析表明:在“1%FDR”过滤标准下,共检测出6160条肽段和4769个蛋白,明确了黄连素降解过程中产生的蛋白质及其基本信息。蛋白的GO注释显示,其中35.88%的蛋白具有调控基因的分子功能,25%的蛋白参与细胞组分的构成,另外39.12%的蛋白则主导参与生物过程。KEGG通路信息显示,蛋白参与最多的前三类生物过程分别是抗生素的生物合成、碳代谢和核糖体代谢功能,证明了BDCM可以利用黄连素作为碳源和能源进行正常的生物活动。在FC>3.00,T检验P-value<0.05的标准下共筛选出1352个差异表达蛋白,其中346个归属于BDCM。BDCM中存在上调差异蛋白135个,下调差异蛋白211个,其中B1:Stenotrophomonas maltophilia菌属在代谢过程中发挥主要的协调作用。