黑曲霉(Aspergillus niger),一种广泛存在于自然界的腐生性丝状真菌,是工业上重要的产酶和产酸菌株,尤其是纤维素酶和有机酸。ras基因是小G蛋白Ras家族的成员,其所介导的GTPase蛋白信号途径是丝状真菌感受外界环境信号调控生长发育及基因表达等重要信号转导机制。目前,对黑曲霉ras基因的功能并不了解。因此,GTPase蛋白信号途径中相关基因的研究对于真菌生长发育及代谢产物的获得具有重大的意义和贡献。本试验旨在采用农杆菌介导的同源重组的方法对黑曲霉中的ras基因进行敲除,通过对转化子生物学特性的研究,初步分析ras基因在黑曲霉3.316生长过程中的作用。用已知全基因组测序信息的黑曲霉CBS513.88 ras基因及其上下游的序列信息为模板,设计一对引物,以黑曲霉3.316基因组为模板,PCR扩增ras基因大片段,测序获得确切的序列信息,用生物信息学软件分析ras基因保守区域,确定同源臂长度,加上合适的酶切位点,通过两步酶切,连接的方法构建敲除质粒pPZPtk8.10:ras:hyg,并采用PCR、酶切等方法进行验证。用冻融法将敲除质粒转入根癌农杆菌中,将转有敲除质粒的农杆菌菌液与黑曲霉一定浓度的分生孢子悬液于IM诱导培养基上共培养介导真菌转化,将质粒转化进入黑曲霉细胞中,同源重组整合到基因组相应位置。在筛选浓度为250μg/mL的潮霉素抗性平板上进行初筛,获得68个转化子,再通过扩增其潮霉素基因、ras基因和验证片段验证因同源重组到正确位置的转化子,进而获得一株ras基因敲除子。黑曲霉ras基因敲除子的生物学特性研究。敲除株的生长速度明显较野生型菌株慢,野生型菌株的生长速度约为敲除株的2.18倍。宏观上看,敲除株菌丝生长较为致密,边生长菌丝边产生孢子,且伴随培养时间的增加,菌丝颜色逐渐变深,而野生型菌株的菌丝生长比较疏松,先生长菌丝,再产生孢子;微观上看,敲除株菌丝的分隔明显增多,这可能对真菌的无性繁殖有影响。野生型的生物量明显比敲除株多,约为敲除株的1.78倍。温度的变化对敲除株无明显影响。葡聚糖内切酶酶活力和β-葡聚糖苷酶酶活力都有所下降,尤其是β-葡聚糖苷酶酶活力。说明黑曲霉ras基因的敲除会影响其菌丝生长、分裂和孢子的产生及无性繁殖,并对纤维素酶的酶活有抑制作用。