论文部分内容阅读
原发性肝癌（肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国又是肝癌的高发区。肝癌起病隐匿，发展快，一旦发现多为中晚期，失去了手术机会。射频消融，肝动脉介入化疗栓塞，无水酒精注射等治疗手段临床疗效亦不理想。肝癌组织和肝癌细胞对我们常用的化疗药物如表柔比星、丝裂霉素、5-FU、顺铂等不敏感，化疗的效果较差。中医中药可抑制肿瘤细胞生长、转移，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。姜黄素是从姜黄的根茎中提取的活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、预防和抑制肿瘤生长的作用，而且研究发现姜黄素对肿瘤患者具有一定的免疫调节作用。姜黄素联合现有的常用的化疗药物对肝癌细胞生长抑制作用和对免疫功能的调节作用目前尚不十分清楚。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2(Tumor necrosisfactor-alpha-induced protein-8like-2，TNFAIP8L2, TIPE2)是新近发现的重要的免疫分子，不仅可以负性调控获得性免疫和固有免疫，而且被视为细胞免疫的重要调节者。同时具有沟通炎症和肿瘤的桥梁的作用，在肿瘤的发生和发展起着重要的作用。FOXP3(forkhead box P3，FOXP3)是叉头样转录因子家族中的成员，主要表达在调节性T细胞上，近年研究发现FOXP3亦可以表达在肿瘤细胞中，具有促使肿瘤细胞逃脱免疫监督的作用。但他们在肿瘤细胞中的表达及对肿瘤细胞的影响的研究尚不多见。近年来发现，传统的抗肿瘤药物表柔比星不仅可以促进肿瘤细胞的凋亡，而且可以通过调节多种免疫细胞和免疫分子影响抗肿瘤的免疫调节作用，但对肝癌细胞的抑制作用尚不令人满意，因此寻找有效的抑制肝癌细胞生长的药物和方法成为科研工作者的重点。人类的多种肿瘤如胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌、肾癌都与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases, PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threoninekinase, AKT)信号通路密切相关。这条通路不但可以调节肿瘤细胞的凋亡，调节肿瘤微环境中的炎症因子的表达，而且研究发现，PI3K/AKT信号通路还可以通过调节免疫分子干预肿瘤的发生和发展。因此，我们通过体外培养HepG2肝癌细胞，单独应用表柔比星及联合姜黄素对HepG2细胞进行干预，观察这些药物对HepG2细胞生存率，细胞中FOXP3，TIPE2表达及对PI3K/AKT信号通路分子的影响，来探讨表柔比星单用或联合姜黄素应用是否可以影响TIPE2，FOXP3表达及对PI3K/AKT信号通路的影响，并探讨其分子机制。目的：研究表柔比星单用或联合姜黄素应用对HepG2肝癌细胞生长的影响及对PI3K/AKT信号通路和相关分子TIPE2和FOXP3的影响，并探讨其分子机制。方法：体外培养HepG2用于研究，取对数生长期细胞接种于96孔板，培养48小时后给予不同浓度姜黄素5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、80μmol/L进行药物干预，分别在24、48小时终止干预，并采用MTT方法检测细胞的存活率，确定姜黄素起作用的最低浓度为20μmol/L。给予不同浓度表柔比星1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μgm/L进行药物干预，分别在24、48小时终止干预，确定表柔比星起作用的最低浓度为2μg/mL。取对数生长期细胞接种于96孔板，分为对照组，表柔比星组（2μg/mL）、姜黄素（20μmol/L）联合表柔比星（2μg/mL）组，以同样的方法干预HepG2细胞，分别在24、48小时采用MTT方法检测细胞的存活率；取对数生长期细胞分为对照组、表柔比星组和姜黄素组，以同样的方法和浓度的干预HepG2细胞提取细胞总RNA和总蛋白，应用RT-PCR方法检测HepG2细胞中TIPE2、PTEN、AKT、NF-κB、FOXP3的表达；应用Western-blot方法检测HepG2细胞中PTEN和AKT蛋白的表达。结果：1姜黄素、表柔比星及表柔比星联合姜黄素对HepG2细胞生长和存活的影响：MTT结果显示：随着姜黄素浓度和干预时间的增加，HepG2细胞的存活率逐渐下降，姜黄素浓度为5μmol/L和10μmol/L时，HepG2细胞存活率下降并不明显，浓度为20μmol/L细胞生存率开始迅速下降，因此确定20μmol/L为姜黄素最低有效浓度。24和48小时时姜黄素5μmol/L和姜黄素10μmol/L，姜黄素40μmol/L和姜黄素50μmol/L相比较，P>0.05，差异无统计学意义，各时间点内其余各组间比较，P<0.05，差异有统计学意义。表柔比星亦抑制HepG2细胞的生长，随着表柔比星干预的浓度和时间的增加，细胞的生存率也呈下降趋势，确定表柔比星2μg/ml为最低有效浓度。表柔比星不同浓度各时间点内各组间比较，P<0.05，差异有统计学意义。而且MTT结果显示表柔比星2μg/ml联合姜黄素20μmol/L较单用表柔比星组细胞存活率明显下降P<.0.05，两组之间比较差异有统计学意义。2表柔比星单独及联合姜黄素对HepG2细胞中TIPE2、PTEN、AKT、NF-KB及FOXP3mRNA及PTEN、AKT蛋白影响：RT-PCR结果显示：表柔比星组与对照组比较，表柔比星组AKT、NF-KB和FOXP3mRNA的表达下降（P<0.05），PTEN和TIPE2mRNA的表达上升（P<0.05），二组之间有统计学差异；姜黄素联合表柔比星组和表柔比组相比较，联合组AKT、NF-κB和FOXP3mRNA表达下降（P<0.05），PTEN和TIPE2mRNA的表达上升（P<0.05），二组之间有统计学差异。Western-blot结果显示：表柔比星组与对照组比较，表柔比星组AKT蛋白表达下降（P<0.05），PTEN蛋白表达上升（P<0.05），二组之间有统计学差异。姜黄素联合表柔比星组和表柔比组相比较，联合组AKT蛋白表达下降（P<0.05），PTEN蛋白表达上升（P<0.05），二组之间有统计学差异。结论：1姜黄素及表柔比星以浓度和时间依赖的方式导致HepG2肝癌细胞生存率下降，MTT法确定20μmol/L为姜黄素作用的最低有效浓度，2μg/ml为表柔比星作用的最低有效浓度。2姜黄素（20μmol/L）联合表柔比星（2μg/ml）增加了表柔比星抑制细胞生存率的作用。3表柔比星可能通过上调TIPE2抑制PI3K/AKT信号通路,导致FOXP3的表达下降，而姜黄素联合表柔比星加强了这一作用，从而提高了抗肿瘤的免疫调节作用。