人脐带间充质干细胞分泌的胞外囊泡对施万细胞增殖和迁移影响的研究

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目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)源胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)对施万细胞(schwann cells,SCs)增殖和迁移的影响,为修复周围神经损伤提供新的治疗方向和新的思路。本课题通过提取、培养人源性脐带间充质干细胞胞外囊泡并与大鼠坐骨神经的SCs相互作用,从体外、体内证实hUCMSC-EVs促进SCs的增殖与迁移,促进受损神经的修复,为组织工程应用胞外囊泡修复受损周围神经的研究提供理论依据与实践探索。方法(1)人脐带间充质干细胞的分离和鉴定。(2)应用超高速离心法从hUCMSCs上清液中分离和纯化EVs(hUCMSC-EVs),透射电镜观察EVs形态特征。Western blot法检测EVs标志性蛋白CD63和CD9的表达。(3)施万细胞(Schwann cell,SCs)提取及鉴定。(4)通过CCK-8和TranswellTM小室实验检测不同浓度的hUCMSC-EVs对SCs增殖和迁移能力的影响。(5)共聚焦显微镜观察原代SCs对EVs的内吞。(6)hUCMSC-EVs在坐骨神经损伤部位示踪,提示hUCMSC-EVs在大鼠体内定向向SCs迁移。(7)建立大鼠坐骨神经横断损伤模型,向其注射EVs,体内观察EVs对SCs增殖和迁移的作用。结果(1)分离人脐带间充质干细胞,结果显示,hUCMSCs呈现长梭形或者漩涡样;流式细胞仪检测hUCMSCs表面标记,结果显示,hUCMSCs表现为CD14、CD19、CD34、CD45低表达,CD73、CD90高表达。而且,hUCMSCs可诱导为成骨实验阳性;成脂实验产生脂滴。(2)透射电镜结果显示,hUCMSC-EVs呈圆形或椭圆形的膜性结构;粒径范围为80-650nm,平均在168nm左右;同时表达特异性分子标志物CD9和CD63。(3)提取新生SD大鼠原代SCs,培养后细胞形态均一、生长良好、呈梭形,经S100和GFAP双荧光染色后,证实提取出的细胞为施万细胞。(4)与对照组相比,hUCMSC-EVs显著促进原代SCs增殖(P均<0.05)和迁移(P均<0.05),并呈剂量-效应关系。(5)hUCMSC-EVs与原代SCs孵育后可发生细胞膜融合。DIO绿色荧光标记的hUCMSC-EVs与DAPI标记的大鼠SCs细胞核,共孵育后,共聚焦显微镜观察显示,大鼠原代SCs可内吞hUCMSC-EVs。(6)DiR标记的hUCMSC-EVs在大鼠体内的追踪,大鼠坐骨神经损伤后,hUCMSC-EVs在损伤处聚集,并可能调节其炎症反应。(7)体内hUCMSC-EVs促使SCs的增殖和迁移。结论hUCMSC-EVs可通过促进原代SCs的增殖和迁移,促进周围损伤神经修复。
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