前言：先天性心脏病(Congenital Heart Disease，CHD)是常见重大出生缺陷，在活产儿中发病率为4.05‰～12.3‰，占新生儿非感染性死亡原因首位。80％CHD仅表现为心脏畸形而不伴有其他系统先天异常，称为单纯性CHD。长期研究证实CHD主要由于胚胎时期遗传与环境因素共同作用引起，其中遗传因素具有重要作用，遗传率为55％～65％。　　 关于CHD的分子遗传学研究有助于阐明其发生机制，从而使预防成为可能。不仅如此，有证据提示某些CHD相关基因还参与成体心脏正常功能的维护。心脏的形成过程十分复杂，涉及在很短时间内细胞的精确迁移、分化和多种来源细胞的整合，其间的遗传或环境因素所引起的任何紊乱都可能导致CHD。这也是CHD一直保持较高发病率的原因。既往研究已证实转录因子异常是CHD的主要遗传学病因，其中NKX2-5、TBX5、GATA4为单纯性CHD3个最主要的致病基因。大量研究证实TBX5可通过蛋白-蛋白相互作用在心脏早期发育中扮演关键角色。　　 本课题组之前对61个单纯性CHD核心家系、共216位成员TBX5基因的8个外显子进行了突变检测，尽管未发现任何突变，但证实TBX5基因的表达呈下降趋势。据此推测该变化可导致与TBX5相互作用的其它因子作用异常，再通过某种途径影响心脏正常发育，最终导致心脏畸形。　　 为深入明确此途径，本研究应用免疫共沉淀法，筛选出与TBX5相互作用的蛋白，经质谱分析及Western Blot验证确定该蛋白为心脏α肌动蛋白(Alpha-cardiacactin，ACTC1)。　　 区别于以往CHD相关基因多为转录因子，ACTC1基因为一种心脏特异表达的结构基因。多数研究提示此基因异常与心肌病(肥厚型心肌病及扩张型心肌病)的发生密切相关。2008年Matsson等在对房间隔缺损(atrial septal defect，ASD)家系的研究中发现，该基因突变可导致家族性房间隔缺损。本研究旨在进一步探讨ACTC1基因与散发单纯性先天性心脏病的关系，并从基因调控、心肌细胞凋亡方面探讨其导致心脏发育异常机制。　　 方法：　　 标本：33例先天性心脏病及12例心脏结构正常心肌组织标本由中国医科大学盛京医院、陆军总院心脏外科及沈阳军区第202医院病理科提供，标本使用经患者监护人知情并同意。成年SD大鼠购自中国医科大学实验动物中心，实验过程遵照动物保护条例。H9C2(大鼠胚胎心肌细胞)购自上海生科院细胞库。　　 1、ACTC1基因与先天性心脏病的相关性研究(1)DNA直接测序检测ACTC1基因编码区突变PCR扩增33例先天性心脏病心肌组织标本ACTC1基因编码外显子，直接测序法筛查编码外显子突变情况。　　 (2)实时定量RT-PCR，免疫组织化学及Western-Blot法研究ACTC1基因在CHD心肌组织中的表达分别提取CHD及心脏结构正常心肌组织RNA和蛋白质，予实时定量RT-PCR及Western-Blot检测ACTC1基因mRNA及蛋白表达；制备上述心肌组织石蜡包埋切片，免疫组织化学方法检测ACTC1蛋白定位及表达。　　 (3)TUNEL法检测CHD心脏组织心肌细胞凋亡及其与ACTC1基因表达相关性分析石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，DAB显色，复染，抗ACTC1抗体特异染色标记心肌细胞，脱水，封片。显微镜下计数TUNEL阳性细胞数。对TUNEL阳性细胞比率与ACTC1基因表达水平进行相关分析。　　 (4)实时定量RT-PCR检测心肌组织Caspase-3、Bcl-2基因表达实时定量RT-PCR检测CHD心肌组织凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达(5)RNA干扰设计合成Actc1-siRNA，转染H9C2细胞系，提取转染后RNA及蛋白，实时定量RT-PCR及Western Blot检测Actc1-siRNA干扰效应。　　 (6)TUNEL法检测RNAi后心肌细胞凋亡将转染后心肌细胞固定，TdT酶及核苷酸混合液孵育，DAB显色，复染，脱水，封片，显微镜下观察、计数TUNEL阳性细胞。　　 (7)AnnexinV/PI双染及流式细胞术检测心肌细胞凋亡将转染后H9C2细胞进行AnnexinV/PI双染后，流式细胞仪检测凋亡心肌细胞率。　　 (8)实时定量RT-PCR检测转染后H9C2细胞Caspase-3、Bcl-2基因表达收集转染后细胞，提取总RNA，实时定量RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3，Bcl-2 mRNA表达。　　 2、NKX2.5调控Actc1基因表达的研究(1)Western-Blot、免疫组织化学、细胞免疫荧光法检测NKX2.5及ACTC1表达Western-Blot检测E12.5d大鼠胎鼠心脏组织中NKX2.5及ACTC1表达；免疫组织化学法检测E12.5d大鼠胎鼠心脏中ACTC1组织定位。细胞免疫荧光法检测NKX2.5及ACTC1在大鼠胎鼠心肌细胞系H9C2中细胞定位。　　 (2)P-MATCH软件预测大鼠Actc1基因5’上游序列转录因子的结合位点获取Actc1基因5’上游1500bp序列信息(http：//www.ensembl.org)，应用P-MATCH软件预测其转录因子结合位点。　　 (3)荧光素酶报告基因系统PCR扩增Actc1基因启动子序列，构建荧光素酶报告载体pGL4-Actc1。pGL4-Actc1和pcDNA-NKX2.5转染COS7及H9C2细胞，观察NKX2.5对Actc1的转录调控作用。　　 (4)凝胶阻滞实验E12.5d胎鼠心肌组织核蛋白和3’生物素标记的探针在凝胶阻滞缓冲液中室温结合1小时，10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、紫外交联后，应用化学发光检测系统检测结果。　　 (5)染色质免疫沉淀实验提取E12.5d胎鼠心肌组织染色质，甲醛交联、酶切后应用NKX2.5抗体沉淀，沉淀下的染色质通过PCR扩增检测结果。　　 结果：　　 1、33例CHD心肌组织标本中未发现ACTC1基因编码区突变，但存在ACTC1基因表达下调(26/33，78.8％)。　　 2、CHD患者心肌标本TUNEL阳性心肌细胞凋亡率增加，Caspase-3表达上调，Bcl-2表达下调。　　 3、转染Actc1-siRNA后，TUNEL/AnnexinV阳性。H9C2细胞数增加；Caspase-3表达上调，Bcl-2表达下调。　　 4、在E12.5d胎鼠心脏中NKX2.5和ACTC1分别表达于心肌细胞核及细胞质中。　　 5、在大鼠Actc1基因启动子区域(-1066)存在NKX2.5的可能结合位点。　　 6、外源表达NKX2.5可明显激活大鼠胚胎心肌细胞H9C2中Actc1基因表达。　　 7、NKX2.5通过与NKX2.5结合位点(-1066)结合发挥转录调控作用。　　 8、在体外NKX2.5蛋白可以和Actc1基因启动子区位点(-1066)直接结合。　　 9、在E12.5d大鼠胚胎心脏发育过程中NKX2.5可以和Actc1基因启动子区NKX2.5结合位点(-1066)直接结合。　　 结论：　　 1、胚胎发育过程中，ACTC1基因表达下调可能与CHD的发生有关。　　 2、ACTC1表达下调可诱导心肌细胞凋亡，可能与先天性心脏病的发生相关。　　 3、大鼠胚胎心脏发育过程中NKX2.5可与NKX2.5结合位点(-1066)直接结合调控Actc1基因表达。