目的颞叶癫痫是癫痫中最常见的类型。颞叶癫痫的病因和补偿机制较多。其中一种机制是人类和癫痫大鼠模型中海马主细胞的数目变化及其轴突出芽。目前大部分关于海马神经组织的认识都来自于对这些主细胞的研究。最近人们才将研究重点转移到了颞叶癫痫模型中调节神经元相互作用的抑制性中间神经元上,已有关于海马区域GABA能中间神经元对兴奋毒性损害易损性的报道。但对于该区域不同时间点钙视网膜蛋白(calretinin, CR)阳性中间神经元的变化,目前还知之甚少。方法本研究在中国湖南省长沙市中南大学湘雅医院完成。应用匹罗卡品诱导癫痫持续状态(status epilepticus, SE)制成慢性癫痫大鼠模型。220只大鼠被随机分成两组：癫痫大鼠组(n=170)：腹腔内注射氯化锂-匹罗卡品；正常对照大鼠(n=50)：腹腔内注射生理盐水。癫痫大鼠又被随机分为两个亚组：预实验组(n=50)：首剂给予匹罗卡品30mg/kg,后每间隔30min反复给予低剂量匹罗卡品10mg/kg;癫痫组(n=120)：首剂给予匹罗卡品25mg/kg,后反复给予匹罗卡品10mg/kg,在给予匹罗卡品前24小时腹腔内注射氯化锂。按照Racine标准,根据大鼠的运动性发作对每只匹罗卡品致痫大鼠进行评分。对来自不同时间点(SE后2h、6h、1d、3d、7d、15d、30d和60d)的癫痫大鼠以及相应年龄的对照大鼠脑切片进行免疫组化,以了解痫性发作后海马神经元所受的影响。行Niss1染色观察海马病理学改变。结果预实验组中有60%大鼠致痫成功,10%大鼠死亡,30%未进入癫痫持续状态,致痫不成功。癫痫组中死亡率为10%,致痫成功率85%。与正常大鼠相比,癫痫大鼠海马亚区存在神经细胞的缺失。本研究结果显示,SE后7d、30d和60d癫痫大鼠海马门区、CA1区和CA3区细胞缺失最明显。对照组与癫痫组之间有明显统计学差异(P<0.05)。同样SE后1天的门区也有明显的细胞缺失(P<0.05)。定量分析显示SE后1d、30d和60d癫痫大鼠CR阳性中间神经元数目与对照大鼠的相比有明显的统计学差异(P<0.05)。两组大鼠中这些中间神经元在门区、CA1区和CA3区都有分布,但正常大鼠海马中中间神经元的数量更多。SE后7d和15dCA区域CR阳性中间神经元的一过性增加被观察到(P>0.05)。癫痫大鼠中CR中间神经元主要分布于门区和CA1区,正常对照大鼠中CR中间神经元主要分布于门区。结论本研究结果提示,相比腹腔内注射30mg/kg匹罗卡品的方法,在氯化锂预处理后腹腔内注射25mg/kg匹罗卡品更能有效促使大鼠癫痫的发生。癫痫大鼠海马CR阳性抑制性中间神经元的数量与对照大鼠的相比存在明显差异。CR阳性中间神经元的数目和分布变化引起的海马抑制性回路的功能性改变可能在平衡兴奋性输入增强中起补偿作用。目的脑区域由基本的局部回路和细胞群组成,其中任一局部异常都有可能发展成癫痫。回路又由具有区域特异性的特殊类型神经元构成。颞叶癫痫是难治性癫痫中最常见的类型,海马是颞叶癫痫中受影响最大的区域。颞叶癫痫的临床特征是在早期的神经损伤后,经过一段潜伏期,再出现难治性的自发性反复复杂部分性发作,提示颞叶癫痫患者脑中可能存在着随着时期变化的一系列异常结构重组。匹罗卡品致痫模型模拟了人类颞叶癫痫的发展过程,在匹罗卡品诱导癫痫持续状态后最终导致反复的自发性痫性发作。目前关于人类颞叶癫痫和大鼠模型中齿状回颗粒细胞苔藓纤维出芽引起海马兴奋性回路重组的报道较多,但颞叶癫痫中海马回路的其它异常构成,特别是颞叶癫痫海马抑制性回路的重组还不清楚。本研究中,拟利用荧光金(FG)确定颞叶癫痫慢性期大鼠海马锥体细胞的突触联系,联合应用钙视网膜蛋白(CR)和FG观察慢性期大鼠海马CA1区CR阳性抑制性中间神经元的起源和突触联系。方法大鼠被随机分为两组：癫痫大鼠组和正常对照组。癫痫大鼠在腹腔内注射氯化锂18-24小时后注射匹罗卡品30mg/kg,接着每间隔30min给予10mg/kg匹罗卡品,直至癫痫持续状态的发生,对照组同时腹腔内注射相应剂量的生理盐水。根据Racine标准对癫痫大鼠进行评分。致痫后两月,利用Kopf立体定位仪和汉密尔顿微量注射器将逆行性示踪剂注射入两组大鼠海马特异的靶位。荧光金被微量注射入海马CA1区。术毕大鼠回笼喂养5到7天,然后灌注取材,行免疫荧光观察大鼠海马中FG标记的细胞以及FG和CR双标记的中间神经元。结果在氯化锂-匹罗卡品模型中,55%大鼠致痫成功发展成SE,20%大鼠死亡,25%未致痫成功。致痫成功大鼠中又有25%在制作过程中死亡从而被剔除。本研究首次发现匹罗卡品致痫大鼠中存在大量FG标记的CA1和CA3锥体细胞,对照大鼠中亦存在大量FG标记的CA1锥体细胞。FG标记的CR阳性中间神经元在两组中均被观察到。海马CA1区FG标记的CR阳性中间神经元和单标记的CR阳性中间神经元与对组组相比无明显变化(P>0.05)。FG标记的CR阳性中间神经元在实验组的CA1、CA3和门区以及对照组的CA1区均可被观察到。结论本研究结果提示,大鼠海马中存在两种FG标记的钙视网膜蛋白阳性中间神经元的联系途径,第一种是癫痫大鼠中CA3至CA1的抑制性突触联系和门区至CA1的抑制性突触联系,第二种途径是大鼠中CA1区之间的抑制性突触联系。癫痫大鼠慢性期存在锥体细胞之间的突触重组。CR神经元可能部分来源于CA1远隔区域CR中间神经元的轴突出芽。目的海马是颞叶癫痫的重要结构基础。海马谷氨酸能介导的兴奋性和GABA能介导的抑制性之间的失衡是颞叶癫痫发生的重要机制之一。表达钙结合蛋白,特别是表达微清蛋白(PV)的抑制性GABA能亚型,在控制主细胞兴奋性中起重要作用。它们分布的位置和数量的不同可能导致大量神经元的异常同步化和过度放电,从而引起癫痫的发生。海马在神经系统中与癫痫相关,且在颞叶癫痫中存在选择性的细胞变性。本研究中,我们拟观察持续状态后大鼠不同时间点海马各亚区的神经病理学改变。方法100只SD大鼠被随机分为两组：癫痫大鼠组,应用氯化锂-匹罗卡品方案诱导痫性发作；正常对照组,大鼠腹腔内注射生理盐水。在给予30mg/kg匹罗卡品前注射氯化锂。在癫痫持续状态持续一小时后,腹腔内注射水合氯醛中断痫性发作。行尼氏染色和微清蛋白免疫组化观察氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马亚区的神经病理学变化。结果癫痫大鼠中,55%大鼠致痫成功,40%死亡,5%未致痫成功。4只发作频率低。从注射匹罗卡品至持续状态的发生平均间隔15min。癫痫持续状态后7天和2月大鼠被观察。组织学染色显示CA1和CA3区锥体细胞层细胞缺失最明显。相一致的,免疫组化显示PV阳性神经元和纤维在这些亚区的变化比门区的变化更明显。详细分析进一步证实PV阳性中间神经元在癫痫早期即表现出形态学改变。PV神经元的变性主要在始层被观察到。SE后1天CA1和CA3区PV神经元数目减少(P<0.05),并随着时间的推移越来越少。在SE后2月PV神经元减少最明显(P<0.01)。与SE后24小时相比,SE后2月PV阳性中间神经元明显减少(P<0.05)。结论本研究结果提示颞叶癫痫中海马不同亚区PV阳性神经元的易损性不同。这可能对颞叶癫痫海马回路的纤维输入和输出有影响。目的匹罗卡品是癫痫模型中被广泛使用的诱导剂。腹腔内注射匹罗卡品可以模拟人类颞叶癫痫的临床和神经病理学特征。癫痫持续状态后模型,特别是氯化锂-匹罗卡品模型的使用,对于了解癫痫的病理生理学机制十分有帮助。先前的急性处理方法制作的癫痫动物模型常死亡率很高,而致痫成功率低。本论文第一部分(相关文章已被neuroscience杂志接收)显示,减少匹罗卡品的剂量可使死亡率降低,但致痫成功率不能令人满意。本研究中,我们在匹罗卡品注射前12小时给予氯化锂,并减少匹罗卡品的注射剂量,以期最大程度地减少死亡率和提高致痫成功率。方法本研究在中国中南大学湘雅医院和巴勒斯坦Al Najah大学完成。200只大鼠被随机分为两组：组A,给予氯化锂24小时后首次注射匹罗卡品30mg/kg,后每隔30min注射匹罗卡品10mg/kg;组B,给予氯化锂12小时后首次注射匹罗卡品20mg/kg,后每隔30min注射匹罗卡品10mg/kg直至诱导SE。SE持续60分钟时,腹腔内注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)终止发作。结果组A中,诱导SE所需的平均匹罗卡品剂量为32mg/kg,组B中平均匹罗卡品剂量为22mg/kg。在终止SE时,组A中62%大鼠被诱导SE成功,17%死亡,21%未进行癫痫持续状态；而组B中几乎100%大鼠被诱导SE成功,死亡率为零,明显低于组A的死亡率。所有SE持续60min的大鼠最终均出现慢性自发发作。两组大鼠SE至首次自发发作的平均潜伏期均为15-30天。两组大鼠自发发作的频率和严重性无明显差异。结论本研究结果提示,当缩短氯化锂预处理的时间间隔和减少匹罗卡品的剂量时,大鼠的SE发生率明显增高,死亡率明显降低。