动脉粥样硬化是由多因素综合作用诱发的慢性疾病，近年来研究发现, 趋化因子及其受体参与许多心血管疾病的发生、发展,如动脉粥样硬化、心肌炎、心肌病等。基因敲除动物实验研究结果表明抑制趋化因子及其受体活性能减轻动脉粥样硬化的发生发展。结合磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受体(SR-PSOX)与CXCL16（CXCL16）为同一分子，首先在经PMA(佛波酯)诱导的巨噬细胞cDNA文库中被克隆，是趋化因子α家族中的新成员，可以膜结合与分泌两种蛋白形式存在。人类的SR-PSOX基因定位于染色体17p13上，与其他已知的趋化因子位点分隔。SR-PSOX的阅读框架编码254个氨基酸，分子量约为30000。该趋化因子由N端27个氨基酸的信号肽、90个氨基酸残基的功能结构域、84个氨基酸残基的黏蛋白样结构域、25个氨基酸的疏水性跨膜区及28个氨基酸残基的短胞质尾序列组成。 SR-PSOX主要在抗原递呈细胞如树突状细胞、巨噬细胞中表达。免疫组织化学及定量逆转录酶链反应显示，在动脉粥样硬化病变、风湿性心瓣膜疾病及感染性心内膜炎SR-PSOX表达于巨噬细胞、动脉平滑肌细胞及血管内皮细胞，而在正常动脉组织中未见其表达。SR-PSOX受体主要在CD8T细胞、NKT细胞和CD4T细胞上表达。SR-PSOX可强烈趋化激活的CD8+T细胞，达整个T细胞的40﹪，对激活的CD4+T细胞趋化作用较小。SR-PSOX可增加细胞间黏附和诱导NF-κB依赖的主动脉平滑肌细胞增殖，进而可能在动脉粥样硬化病变的发生、发展中起到重要的作用。但SR-PSOX在As发生发展中的具体作用和机制还未完全阐明。因此本文首先观察SR-PSOX在急性冠状动脉综合征患者外周血单个核细胞表达是否发生改变。然后，一方面通过构建SR-PSOX基因慢病毒表达载体，转染平滑肌细胞过表达SR-PSOX，研究SR-PSOX在介导胆固醇流入细胞中的作用；另一方面应用RNA干扰技术沉默SR-PSOX基因，观察SR-PSOX对平滑肌细胞迁移的影响。 第一部分SR-PSOX在急性冠状动脉综合征患者外周血单个核细胞与感染性心内膜炎患者血管组织中的表达 目的：观察急性冠状动脉综合征(ACS)患者外周血单个核细胞SR-PSOX表达的规律,探讨其在冠心病发病机制中的作用。 方法：选取(ACS)病人40例,其中急性心肌梗死(AMI) 病人20例,不稳定性心绞痛(UAP) 病人20例,同时选取冠脉造影正常对照20例。用冠脉造影法确定病例分组正确。提取ACS患者和正常对照组外周血单个核细胞，采用RT-PCR 法扩增SR-PSOX，以β-actin的表达作为内参照，比较趋化因子SR-PSOXmRNA表达的变化。采用Western Blot方法分析蛋白表达水平,比较ACS各亚组患者SR-PSOX的表达情况。随机选取感染性心内膜炎和正常人的血管石蜡切片，用激光共聚焦分析SR-PSOX表达情况。 结果：ACS患者外周血单个核细胞 SR-PSOX mRNA和蛋白质的表达显著高于正常对照组，而ACS中UAP组和AMI组SR-PSOX的表达差异无显著性。免疫荧光法检测SR-PSOX在血管组织中的表达，结果显示正常血管内皮细胞有弱的SR-PSOX表达，而感染性心内膜炎患者血管SR-PSOX表达增强。 结论：ACS 患者外周血单个核细胞和感染性心内膜炎患者血管SR-PSOX的表达增强。 第二部分人SR-PSOX基因慢病毒表达载体构建及功能分析 目的：构建结合磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受体(SR-PSOX)与6个组氨酸（His）融合基因慢病毒表达载体，以研究SR-PSOX在动脉粥样硬化发病机制中作用。 方法：采用RT-PCR方法获得SR-PSOX全外显子片段,通过TOPO酶快速连接pLenti6/V5慢病毒穿梭质粒中,经PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装质粒混合物与SR-PSOX -pLenti6/V5 TOPO共转染病毒包装细胞293FT,48h后,收集病毒上清,浓缩,鉴定。采用SDS-PAGE、蛋白印迹、间接免疫荧光法分别检测重组人SR-PSOX基因的慢病毒结合氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的多种泡沫细胞模型不同时点，内、外源性SR-PSOX与肿瘤坏死因子TNF-α蛋白表达。 结果：DNA测序分析证实RT-PCR获得的SR-PSOX产物与GenBank中的数据完全吻合; SR-PSOX-pLenti6/V5 TOPO重组体阅读框无移码及碱基突变，免疫印迹法、间接免疫荧光法检测SR-PSOX、TNF-α在泡沫细胞形成中表达上调，SDS-PAGE、蛋白印迹显示过表达外源性重组人SR-PSOX基因可促进泡沫细胞形成及促使炎症因子TNF-α表达上调。 结论：成功构建结合磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受体(SR-PSOX)与6个组氨酸（His）融合基因慢病毒表达载体，为SR-PSOX在动脉粥样硬化发病机制中作用奠定基础。 第三部分发夹式siRNA慢病毒表达载体构建及对人SR-PSOX基因表达的影响 目的：SR-PSOX／CXCL16是近年来新发现的一种因子，与动脉粥样硬化的发展密切相关，但其功能尚不明确。构建SR-PSOX-siRNA慢病毒表达载体以明确其功能。 方法：在基因功能的研究领域，RNAi可特异、高效、快速地产生针对特定基因的沉默效应，被广泛应用于哺乳动物基因功能的研究。本研究通过基因克隆技术构建针对人SR-PSOX基因的发夹式siRNA (shRNA)入门载体, 测序正确后使用LR重组技术构建相应的shRNA慢病毒表达载体，PCR鉴定挑选得到正确重组子，脂质体介导转染法包装入病毒宿主293FT细胞，72h后收集含假病毒颗粒的上清液,体外直接感染表达SR-PSOX的人肝母细胞瘤细胞系（HepG2）。通过RT-PCR、间接免疫荧光法及Western印迹法检测人SR-PSOX的表达水平。 结果：shRNA慢病毒表达载体可使人SR-PSOX基因的mRNA 和蛋白表达量显著下降，抑制率达到80％，可在培养细胞中有效的沉默人SR-PSOX基因。 结论：成功构建SR-PSOX-siRNA慢病毒表达载体从而为研究该基因的功能提供了RNA干扰技术平台。