HMGB1参与大鼠肝移植急性排斥反应的作用及机制

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研究目的:免疫排斥反应在肝脏移植中是不可避免的,严重威胁供肝的存活和功能,诱导稳定的移植物免疫耐受是肝移植成功的关键之一。虽然高迁移率族蛋白-1(High-mobility group box 1,HMGB1)已被证实为肝脏缺血再灌注损伤的关键因子,但HMGB1在肝移植术后免疫排斥反应中的具体作用和机制尚未明确。本文通过大鼠肝移植急性排斥模型及原代树突状细胞及T淋巴细胞的培养等体内及体外研究,明确肝移植术后急性排斥反应阶段中HMGB1蛋白的表达及其对免疫反应的调节,以期其对临床上肝移植术后免疫耐受状态的诱导及长期维持发挥作用,从而提升患者生存质量延长生存期。研究方法:1、构建原位肝移植急性排斥动物模型:采用改良式Kamada’s“二袖套法”的手术方法建立稳定的MHCⅡ分子错配的大鼠原位肝移植模型,同种异基因移植组(Allograft组)以Lewis大鼠为供体、Brown Norway大鼠(BN大鼠)为受体,同种同基因移植组(Syngraft组)供体、受体均采用BN大鼠以及未手术的BN大鼠作为未手术对照组(Sham组)。分别收集供体术后5d、10d的肝组织新鲜样本,通过肝组织病理学染色及免疫组化明确移植模型的病理改变。2、大鼠肝移植急性排斥模型中HMGB1的表达情况:免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测移植物肝组织中HMGB1蛋白的表达及CD86+DC细胞的分布情况;ELISA检测样本中HMGB1蛋白的表达及炎症因子的分泌情况;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,Q-PCR)检测移植物中HMGB1 m RNA的表达情况。3、HMGB1体外诱导培养骨髓单核细胞源性的树突状细胞(Monocyte-derived dendritic cells,Mo-DCs)及对初始T淋巴细胞的分化影响:流式细胞术检测HMGB1体外诱导培养的Mo-DCs成熟,以及对初始CD4+T淋巴细胞增殖及分化的影响。结果:1、成功构建了大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,HE染色结果显示Allograft组肝脏组织标本术后5d及10d的HE染色结果表现为典型的急性细胞性排斥反应的三联征;此外,CD3免疫组化结果显示Allograft组汇管区CD3+T淋巴细胞强阳性。2、术后血清样本ELISA检测,其中Allograft组中各炎症因子IL-6、TNF-α、IFN-γ较Syngraft组高(P<0.05)。Allograft组中HMGB1蛋白及m RNA的表达均高于Syngraft组(P<0.05)。CD86免疫组化结果显示Allograft组中DCs的浸润明显高于Syngraft组。3、Mo-DCs在HMGB1蛋白的刺激下被诱导成熟,流式细胞术显示DCs表面标志物CD80、CD86及MHCⅡ均高于PBS组;CFSE结果显示混合淋巴细胞培养中HMGB1诱导CD4+T淋巴细胞增殖,此外胞内细胞因子检测显示HMGB1刺激组中IL-17和IFN-γ分泌较PBS组增多。结论:1、Lewis大鼠和BN大鼠可成功构建稳定的原位肝移植急性排斥反应动物模型。2、HMGB1参与了大鼠肝脏移植急性排斥反应的发生,通过促进Mo-DCs和T细胞在供肝募集,并促进Mo-DCs成熟进而促进供体特异性的Th17及Th1免疫应答。
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