研究背景生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,细胞膜上的糖蛋白糖链结构与肿瘤的粘附、入侵及转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-V, GnT-V)为糖蛋白N-糖链加工酶之一,起着决定N-粮链类型及复杂型糖链结构的重要作用,主要分布在高尔基体中,能催化形成N-糖链的β-1,6分支,p-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖分支在肿瘤组织含量丰富,与肿瘤的转移、恶性转化等生物学活性密切相关。GnT-V影响肿瘤生物活性主要是通过改变细胞表面糖蛋白如钙黏蛋白、整合素及细胞表面生长因子受体的β-1,6分支结构。另外分泌型GnT-V在肿瘤细胞外基质中有一种引起肿瘤血管生成的新功能,而且与糖基转移酶催化活性无关。GnT-V (?)舌性在许多恶性肿瘤组织中表达增高,如乳腺癌、结肠癌和肝癌。人乳腺癌细胞系中,GnT-V表达与肿瘤的大小成正相关；高转移结肠癌细胞株中,GnT-V (?)舌性与肿瘤侵袭转移能力成正相关。然而,在非小细胞肺癌和膀胱癌中,GnT-V的表达量越低,肿瘤的恶性程度反而越高。因此,GnT-V在不同肿瘤中的作用是不一样的。前列腺癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一,发病随年龄而增氏,其发病率有明显的地区差异,欧美地区较高。据报道仅次于肺癌,在男性是癌症死亡的第二位。前列腺癌主要治疗手段有根治性手术和内分泌治疗、放疗及化疗。根治术后复发、发生远处转移及无法耐受手术的患者多选择内分泌治疗。接受内分泌治疗的患者,大多数起初有效,但经过中位时间14-30个月后,几乎都将逐渐发展为激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌。如何有效地治疗激素非依赖性前列腺癌或激素抵抗性前列腺癌依然是基础和临床研究的热点和难点。化疗常用于激素非依赖性前列腺癌,但对患者的治疗效果仍有限。而放射治疗可对局限性前列腺癌进行根治性放疗,也可作为手术治疗的辅助治疗和晚期患者的姑息性治疗。但临床发现部分病人因放疗抵抗导致放疗后局部复发,以致患者预后不佳。已经发现的和前列腺癌细胞放射敏感性有关的预测分子有Raf激酶抑制白,PAK6蛋白和DAB2IP基因等。但是目前为止尚未有一个公认的标志性分子能预测前列腺癌细胞的放射敏感性。二、研究目的虽然很多研究表明GnT-V和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但是目前关于GnT-V与前列腺癌恶性生物学行为的相_关研究较少,因此在本研究中,我们采用免疫组化检测GnT-V在前列腺癌组织中的表达情况,以期探讨GnT-V在前列腺癌发生、发展及转移中的作用。同时我们利用shRNA,下调前列腺癌细胞PC3中GnT-V的表达量,得到了低表达GnT-V的细胞株PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079。通过体内及体外实验对比正常的前列腺癌细胞和低表达GnT-V的前列腺癌细胞的放射敏感性,更重要的是,还研究了GnT-V对前列腺癌细胞放射敏感性的内在机制。三、实验方法1、前列腺癌组织芯片制作：由陕西超英生物科技有限公司完成。2、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA质粒的构建及鉴定：由上海吉玛公司完成3、细胞培养及转染人前列腺癌细胞株PC3在37℃5%CO2条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2-3次。PC3细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC3细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。4、干扰效果检测(1) RT-PCR测定GnT-V mRNA用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA.GnT-V上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG3’,下游引物为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA3’。使用β-actin作为内参,上游引物为5’GAAACTACCTTCAACTCCATC3’下游引物为5’CGAGGCC AGGATGGAGCCGCC3’.反应条件为：95℃预变性30s,PCR：94℃5s,60℃30s,共40个循环,溶解曲线：95℃0s,65℃60s,95℃0s.基于目的基因和看家基因实时荧光定量扩增曲线得到Ct(C为Cycle,t为threshold)值,ACT代表目的基因相对于内参基因的表达强度,公式为ACT=Ct目的基因-Ct内参基因。用Folds=2-△△Ct表示实验组目的基因与对照组目的基因表达量的倍比关系,AACt=ACT实验组-ACT对照组。目的基因为GnT-V,内参基因为β-actin。(2) Western blot检测GnT-V蛋白表达提取总蛋白,髟测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入等体积2×上样buffer煮沸7min,离心后吸取30μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人(3-actin蛋白单克隆抗体(1：1000)4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1：500)、HRP标记的兔抗羊IgG(1：5000),室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值,用GnT-V/β-actin代表GnT-V的相对表达量。5、干扰后对前列腺癌细胞放射敏感性的影响(1)平板克隆形成实验检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对PC3细胞放射敏感性的影响取各组对数生长期的待测细胞,接种于6孔板,24h后分别给予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy五个计量点照射,之后置于37℃5%CO2条件下静止培养3周,待出现肉眼可见克隆时,终止培养,加入0.1%结晶紫染色,肉眼计数。通过克隆数计算出细胞生存分数。实验分为PC3组,PC3GnT-V/NC组,PC3GnT-V/1079组和PC3GnT-V/1564组,每组重复例数为9。(2)CCK-8法测定pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰后对PC3细胞单次6Gy照射后增殖能力的影响。取各组对数生长期的待测细胞,消化,计数,制备单细胞悬液,将细胞悬液稀释成终浓度为1×105个/ml接种于96孔板,每孔1×104个细胞,每组细胞6个复孔,铺板后置于37℃5%CO2条件下静止培养24h,给予6Gy照射。CCK-8法分析不同时间点(Oh、24h、48h、72h、96h)的细胞活力,每个时间点分别检测6个复孔。测量两组的OD450nm值,绘制生长曲线,并计算干扰组的生长抑制率。细胞生长抑制率(IR)=(对照组OD450值一干扰组OD450值)/对照组OD450值×100%。实验分为PC3组,PC3GnT-V/NC组,PC3GnT-V/1079组和PC3GnT-V/1564组,每组重复例数为18。(3) Hoechst33258核染色及流式细胞术检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰对PC3细胞照射前后凋亡的影响。取对数生长期的细胞,给予0Gy及6Gy照射,72h后移去培养,用1×PBS洗2次,4%多聚甲醛液室温固定20min,移去固定液,用PBS清洗2次,然后室温孵育终浓度lug／ml的Hoechst33258染色液5分钟。孵育完毕后用PBS简单清洗2次,吸尽液体,滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片。然后在荧光显微镜下观察细胞核形态。实验分为PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组,每组重复例数为9。取对数生长期的细胞,给予0Gy及6Gy照射,72h后消化细胞,1×PBS洗3遍,取1×105个细胞,加入195μLAnnexinv PE结合液重悬细胞,再加入5μLAnnexinv PE和1μL7-AAD轻轻混匀,室温避光孵育10分钟。1000rpm/min离心5分钟,弃上清,加入200μLAnnexinv PE结合液重悬细胞,流式细胞仪检测。实验分为PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组,每组重复例数为9。(4)比色分析法测定Caspase-3(?)舌性取对数生长期的细胞,给予6Gy照射,24、48、72h后,消化离心,预冷的裂解缓冲液冰上裂解细胞20min。4℃20000×g离心3min,收集上清与Caspase-3底物DEVD-P-NA以及反应缓冲液混合,37℃孵育4h,用96孔板在酶标仪405nm比色。PBS作为阴性对照组。重复3次。样品OD(405nm)值与对照样品OD(405nm)值的比值为Caspase-3(?)舌性的百分率。实验分为PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组,每组重复例数为9。(5)流式细胞术检测pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰对PC3细胞照射前后周期的影响。取各组对数生长期的待测细胞,给予0Gy,2Gy,6Gy,10Gy照射,72h后消化细胞,1×PBS洗3遍,取1×106个细胞,加入2ml于-20℃预冷的70%乙醇,4℃冰箱过夜。染色前用PBS离心沉淀去除固定液,冷PBS洗2次。加入100μLRNA酶RNaseA,37℃水后冰上终止RNaseA作用。每ml细胞悬液加入50μg/ml碘化丙啶PI染色液100μL混匀,4℃避光30min。流式细胞仪检测。实验分为PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组,每组重复例数为9。(6) Western blot检测pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA对PC3细胞照射前后凋亡相关蛋白的改变提取总蛋白,测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,用PBS补至20μL,加入5μL5×SDS上样buffer煮沸5min,离心后吸取25μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜后用羊抗人bcl-2蛋白多克隆抗体(1：300)、羊抗人bcl-xl蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人bax蛋白单克隆抗体(1：200)、羊抗人β-actin蛋白单克隆抗体(1：1000)4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1：500)、HRP标记的兔抗羊IgG(1：5000),室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus6.0软件分析条带灰度值,用bax/β-actin代表bax的相对表达量。实验分为PC3组,PC3GnT-V/NC组和PC3GnT-V/1079组,每组重复例数为3。6、体内实验(1)裸鼠成瘤实验6周龄BALB/c裸鼠,雄性。每组各16只。细胞重悬于RPMI-1640,调整细胞浓度为2.5×107/ml,按2001μL/只进行臀部皮下注射。当肿瘤体积达200-300mm3,随机分为两组即处理组和对照组,处理组给予2Gy照射连续5天,对照组不照射。照射后每隔3d测量肿瘤长径和短径,按V=0.5ab2(V代表肿瘤体积,a为长径,b为短径)绘制生长曲线,并记录裸鼠生存时间。(2)生存分析每组取10只裸鼠,建立裸鼠成瘤模型(具体方法同前),记录每只裸鼠的生存天数。7、免疫组化组织芯片及石蜡切片脱蜡和水化后,对组织抗原进行相应的修复。切片加内源性过氧化物酶阻断剂,室温下孵育10分钟,加动物非免疫血清(兔/鼠),室温下孵育20分钟。除去血清,每张切片加一滴一抗(GnT-V多克隆抗体(1：200)、(Bax单克隆抗体(1：200)、Bcl-2多克隆抗体(1：300)、Bcl-xl多克隆抗体(1：300)),室温下孵育60分钟。切片加生物素标记的兔抗羊IgG,室温下孵育10分钟。除去PBS液,每张切片加链霉菌抗生素蛋白—过氧化酶,室温下孵育10分钟。冲洗后滴新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察。自来水冲洗,苏木素复染。6、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。所给数据为均数±标准差。以P<0.05表示有统计学意义。实时定量RT-PCR、Western-Blot实验结果多组比较采用one-way ANOVA分析。平板克隆实验、CCK8细胞增殖实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验多组比较采用析因设计的方差分析；组内多重比较若方差不齐采用DunnettT3法、若方差齐采用LSD法；两组间的比较采用两独立样本t检验。Caspase-3活性检测实验两组间比较采用两独立样本t检验。皮下成瘤试验瘤体体积采用重复测量的方差分析；组内比较采用one-way ANOVA分析；组内的多重比较若方差不齐采用Dunnett T3法、若方差齐采用LSD法。三组生存时间的比较采用Kapl an-Merer法分析。参数比较均先进行方差齐性检验,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验Welch法。四、结果1、重组质粒的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下观察,所有转染细胞均发荧光,说明稳定转染成功。2、干扰效果检测实时定量PCR实验结果得出PC3GnT-V/1564和PC3GnT-V/1079组细胞GnT-V基因的表达较PC3GnT-V/NC组明显降低,表明转染GnT-V shRNA载体能抑制目的基因mRNA表达,Western blot结果也显示转染GnT-V shRNA载体能抑制GnT-V蛋白表达。Image-Pro Plus6.0软件分析GnT-V基因mRNA及蛋白的表达水平,按照公式进行计算后显示PC3GnT-V/1079、PC3GnT-V/1564组mRNA水平的抑制率分别为78.3%和66.8%,蛋白水平的抑制率分别为73.7%和57.9%,与PC3GnT-V/NC组相比均有统计学意义(P<0.001)。3.GnT-V shRNA对细胞放射敏感性的影响(1)、以细胞在不同照射剂量(0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)的克隆形成率绘制细胞生成率曲线,PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079组的生存率较PC3组及PC3GnT-V/NC组低,差异有统计学意义；而PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079组之间差异无统计学意义。说明下调GnT-V的表达后细胞的放射敏感性增高。(2)、以细胞在6Gy放疗后不同时间点(Oh、24h、48h、72h、96h)绘制细胞生长曲线,PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079的生长抑制率较PC3组及PC3GnT-V/NC组高,差异有统计学意义；而PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079组之间差异无统计学意义。可见下调GnT-V的表达后细胞的放射敏感性增高。因PC3GnT-V/1564与PC3GnT-V/1079组细胞GnT-V蛋白表达量相差约10%,其差异不足以影响其放射敏感性(根据平板克隆实验及CCK-8实验结果)。选择干扰效率较高的PC3GnT-V/1079进行下一步实验(在做了平板克隆实验及CCK-8实验之后)。4.GnT-V shRNA对细胞放疗前后凋亡的影响Hoechst33258及流式细胞Annexin V-PE/7-AAD法测定放射前后细胞的凋亡。放射治疗前PC3GnT-V/NC组、PC3GnT-V/1079组细胞的凋亡率分别为：(1.52±0.43)%、(8.81±0.65)%；放射治疗后PC3GnT-V/NC组、PC3GnT-V/1079组细胞的凋亡率分别为：(9.21±0.23)%、(21.39±1.72)%。下调GnT-V可提高PC3细胞放疗后的凋亡率。5.GnT-V shRNA对细胞放疗后caspase-3(?)舌性的影响PC3GnT-V/1079组caspase-3活性在放疗后24h、48h及72h均高于PC3、PC3GnT-V/NC组。6.GnT-V shRNA对细胞放疗前后周期的影响PC3GnT-V/NC组细胞照射后可见明显G2/M阻止；PC3GnT-V/1079组细胞照射后无明显G2/M期阻止。7.GnT-V shRNA对裸鼠皮下成瘤实验的影响X线照射后,PC3GnT-V/1079体积增长较PC3和PC3GnT-V/NC速度慢,差异显著。PC3GnT-V/1079生存期较PC3和PC3GnT-V/NC长。免疫组化实验示：Bcl-2表达于胞浆及细胞核中,PC3GnT-V/1079表达量低于PC3GnT-V/NCBax表达于胞浆,PC3GnT-V/1079表达量高JPC3GnT-V/NC;Bcl-x1表达于胞浆,PC3GnT-V/1079及PC3GnT-V/NC表达量无明显差异。8.GnT-V shRNA对细胞放射前后凋亡相关蛋白表达的影响实验结果表明,PC3GnT-V/1079组细胞在放射治疗后Bax表达量高于PC3及PC3GnT-V/NC组；Bcl-2表达量低于PC3及PC3GnT-V/NC组。9、免疫组化检测GnT-V在前列腺癌组织中的表达实验结果发现：GnT-V在5例前列腺增生组织中不表达,在85例前列腺癌组织中其中83例有表达。且GnT-V在前列腺癌组织中的表达随前列腺癌病理分化程度降低而升高,随着临床分期及Gleason评分增高而升高。五、结论1、GnT-V在前列腺增生组织中不表达,在前列腺癌组织中的表达随前列腺癌病理分级、临床分期及Gleason评分增高而升高。2、靶向GnT-V的shRNA真核表达质粒可以显著下调GnT-V的mRNA和蛋白表达。3、下调GnT-V的表达可以提高PC3细胞的体内及体外放射敏感性。4、下调GnT-V的表达提高PC3细胞放射敏感性的机制可能是通过影响凋亡相关蛋白的表达。5、GnT-V可能成为前列腺癌治疗的靶点。