论文部分内容阅读
羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase,HSDH)在胆汁酸类物质转化、甾体激素转化、胆固醇代谢、非甾体类醛、酮和醌羰基还原等过程中发挥着重要作用,同时,在工业生物催化方面也具有较大的应用潜力。本文以Clostridium absonum 7α-HSDH(CA 7α-HSDH)为研究对象,利用基因工程手段对CA 7α-HSDH的辅酶结合位点进行改造,进一步应用分子动力学模拟分析酶与辅酶的作用细节,阐明CA 7α-HSDH辅酶结合区关键残基的功能。主要研究内容和结果如下:(1)在GST标签融合表达的基础上,本文进一步探索了CA 7α-HSDH关于pTWIN1载体的表达,成功构建了CA 7α-HSDH/pTWIN1表达系统,获取了有良好活性的CA 7α-HSDH,该表达方式的构建为降低CA 7α-HSDH的获取成本,推动工业应用提供了一定基础。(2)通过对三维结构分析,运用定点突变技术,对CA 7α-HSDH的辅酶结合位点进行改造,成功获得了7个突变体T15A、R16A、R38A、R194A、R16A/R194A、R38A/R194A、T15A/R16A/R194A。酶促动力学研究显示,(1)成功获得了活性提高的R16A和R194A突变体,相比于野生型酶活性分别提高1.8倍和4.8倍。二者催化常数(kcat)和米氏常数(Km)均增大,R16A的催化效率(kcat/Km)下降了16.2%,而R194A的催化效率(kcat/Km)增大3倍。(2)T15A、R16A/R194A和T15A/R16A/R194A三个突变体同野生型酶相比,酶活性分别下降了26.8%、55.2%、75.9%。三者催化常数(kcat)降低,米氏常数(Km)增大,催化效率(kcat/Km)分别下降了81.8%、43.4%、84.6%。(3)R38A、R38A/R194A两个突变体未检测到活性,初步推测R38的作用较为关键。(4)从酶促动力学参数发现,保持功能的突变体Km和单点突变体的kcat均增大,推测T15、R16、R194的作用体现在酶与辅酶间亲和力和催化速度方面,相应的,T15和R194分别在维持亲和力和转化底物速度方面有较为突出的贡献。(3)运用MD模拟技术,对上述突变体与辅酶作用的细节进行了研究。(1)结合自由能计算结果显示,与野生型相比,七个突变体与NADP+的结合自由能显著上升,这与酶促动力学实验测得的结果——突变体酶对NADP+的亲和力下降相符。(2)对R38A和R38A/R194A突变体分析发现,阳离子-π作用消失,表明突变体与辅酶的作用模式的改变破坏了NADPH与酶的结合,是突变体失去活性的原因;T15A、R16A、R194A、R16A/R194A、T15A/R16A/R194A这五个突变体未影响R38与辅酶的阳离子-π作用,因而仍然保持生物功能,与酶活实验结果相符,由此表明R38在CA 7α-HSDH与辅酶II结合过程中具有关键作用。(3)将T15、R16、R194单点突变为丙氨酸后,小幅度减弱磷酸基团周围的正电量,T15、R16、R194与2位磷酸基团的氢键作用消失,由此表明,由T15、R16、R194介导的与磷酸基的氢键将直接影响酶与辅酶间亲和力,且亲和力具有一定的最适范围,在该范围内,适当的减弱亲和力有利于酶活、催化效率的提高;另外,将R194突变为丙氨酸后,R194与焦磷酸桥的氢键作用全部消失,导致焦磷酸桥柔性增大,处于反应中心的烟酰胺环运动/解离容易,整体反应速度加快,这与突变实验结果kcat值增加是相符的。(4)联合突变体R16A/R194A和T15A/R16A/R194A中,逐步提高正电量的减少程度,二者的催化效率随电荷量的减少而下降;另一方面,在这两个突变体中,发现S39与2位磷酸基间有极性作用存在,极有可能由于此氢键作用的参与,抵消了二者亲和力的下降程度。由此表明,在酶与辅酶结合的过程中,获得活性和催化效率较好的酶的前提是,保证周围的正电量和最适亲和力。