Vitamin C-Na诱导Hsps表达保护心肌抵抗热应激损伤的作用及机制

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:oliver777
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随着集约化养殖与全球变暖趋势的日益加剧,热应激已成为影响畜禽养殖业发展的重大因素之一。热应激会引起机体各组织、器官的损伤,严重时会引发猝死。研究发现热应激猝死与心肌损伤密切相关,心肌对热敏感,当机体遭受热应激刺激时,心脏成为遭受损伤的重要器官之一。因此,探究热应激导致心肌损伤的机制,以及寻找有效的方法保护心肌细胞免受热应激的损伤已成为科研工作者探索的热点。热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)是机体在受到各种应激因素刺激时在细胞内诱导合成或合成增加的一组高度保守的保护性蛋白质,可以帮助肽链的正确折叠、组装、移位、复性和降解。除此以外,Hsp还参与细胞凋亡、细胞周期和免疫信号通路,是机体重要的内源性保护机制。本文以H9C2心肌细胞热应激作为研究模型,探讨了热应激及恢复条件下H9C2心肌细胞的应激性病理损伤及其Hsps的动态变化规律,以小分子αB-crystallin蛋白为重点,探究其过表达提高H9C2心肌细胞耐热性的分子机制。在此基础上,我们还探究了热休克因子1(Heatshockfactor 1,HSF1)在热应激及恢复条件下调控Hsps表达的分子机制。另外,我们还筛选出抗热应激药物维生素C-钠(vitamin C-Na,VC-Na),从体内、体外角度验证了其诱导Hsps表达和抵抗热应激损伤作用,并对其作用机制进行了阐述。为了观察热应激及应激恢复条件下心肌细胞的应激性病理损伤,以及心肌细胞启动热休克蛋白转录和表达的变化规律,本文在建立心肌细胞热应激与热应激恢复模型基础上,通过组织病理学、RT-PCR和western blot等方法对心肌细胞应激性病理损伤特点、Hsps的转录和翻译水平进行了研究。试验结果显示,42℃热应激持续0.5 h会导致H9C2心肌细胞出现颗粒变性和水泡变性等急性肿胀,应激2 h时尤为明显,可见形成大的空泡,病变在应激恢复生长12h后逐渐减轻。42℃热应激持续5h可导致细胞坏死,恢复生长12h后未见显著性修复效果;热应激0.5 h时,hsp27和hsp 70表现出极显著的诱导差异,CRYAB、hsp47、hsp60、hsp90、hsp110在热应激2h时出现极显著性诱导差异,在应激恢复12h后CRYAB呈现出持续被诱导的趋势,而hsp27、hsp47、hsp60、hsp70、hsp90、hsp110则表现出下降趋势。热应激条件下Hsps蛋白(Hsp27、Hsp47、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp110)的表达量均呈现上升趋势,而 CRYAB的蛋白表达量却呈现出下降趋势,在应激恢复生长12h后,CRYAB、Hsp27、Hsp60、Hsp70、Hsp110的表达量均有增加的趋势,Hsp47的表达量基本恢复至正常水平。由此推断Hsps在抗热应激损伤及热损伤修复过程中发挥着重要作用。本文首先构建稳定过表达CRYAB蛋白的H9C2心肌细胞系,通过对热应激条件下细胞的病理组织学检测、细胞周期检测、CRYAB与骨架蛋白F-actin的共定位检测和细胞凋亡及相关蛋白的检测,研究其在心肌细胞受到热应激时发挥的功能及机制。本研究共筛选出3株细胞,一株转染空白质粒命名为control,另两株分别不同程度过表达CRYAB蛋白,命名为CRYAB-5和CRYAB-7。研究结果发现CRYAB-5和CRYAB-7细胞株都可以明显降低热应激导致的细胞颗粒变性和空泡变性,也可以缓解热应激导致的细胞在G0/G1期的阻滞,且效果与CRYAB的表达量呈正比。间接免疫荧光结果显示,CRYAB在遭受热应激刺激时会由胞质转移至胞核,且CRYAB与F-actin骨架蛋白存在共定位表达,过表达CRYAB可以显著降低热应激导致的F-actin骨架蛋白的聚集。另外,过表达CRYAB蛋白的细胞株可以显著降低热应激导致的细胞凋亡,其可能通过降低cleaved-caspase的表达量发挥抗凋亡的功能。综上结果,过表达CRYAB可以显著提高心肌细胞H9C2的耐热性,且其保护效果与CRYAB过表达量成正相关,但是CRYAB发挥功能的具体机制仍需进一步研究。本研究的目的是通过对HSF1在H9C2心肌细胞遭受热应激与热应激恢复条件下的转录水平、蛋白水平、胞质与胞核的分布变化、三聚化以及HSF1干扰对Hsps转录水平的影响,探究H9C2细胞在遭受热应激及恢复条件下HSF1对Hsps的分子调控机制。研究发现,正常条件下,HSF1主要分布在H9C2细胞的胞质中,当遭受热应激刺激时,HSF1转录水平和蛋白表达量均呈现热应激时间依赖性的显著下调,HSF1的分布会由胞质移位至胞核,且发生磷酸化和三聚化;在热应激消失并恢复12h后,HSF1的转录水平和蛋白表达量会显著上升,HSF1的分布会由胞核重新移位至胞质,磷酸化和三聚化消失。HSF1干扰会导致H9C2细胞在正常条件下Hp47和Hsp60转录水平的升高,而对其他Hsps没有显著性影响。另外,HSF1干扰会显著降低热应激及热应激恢复条件下诱导CRYAB、hsp27、hsp 70、hsp90和hsp110转录水平的升高。本研究将VC和VC-Na作为缓解心肌细胞热应激损伤的备选药物,探究其保护H9C2心肌细胞抗热应激损伤及与Hsps抗应激保护作用间的关系。试验将H9C2细胞随机分为对照组、VC组(20μg/mLVC)和VC-Na组(20 μg/mLVC-Na),研究在遭受0 h,1 h,3 h和5 h热应激后心肌细胞应激性病理损伤、细胞凋亡、LDH、MDA、SOD、ROS和Hsps表达水平等参数的改变。检测结果显示,添加20 μg/mLVC或VC-Na 可以有效降低热应激导致的心肌细胞颗粒变性、空泡变性、核固缩和线粒体损伤,同时可以有效降低细胞凋亡率以及LDH、MDA和ROS的水平;添加20 μg/mLVC或VC-Na可以增加细胞内SOD活性,在热应激3 h时显著增加心肌细胞内CRYAB、hsp27、hsp60和hsp70 的 mRNA水平(P<0.01),在热应激Oh(P<0.05)和 1h(5<0.01)时显著增加CRYAB的蛋白水平,在热应激3h和5h时显著增加Hsp70的蛋白水平(P<0.01)。研究结果表明,添加20μg/mLVC或VC-Na可以通过增强抗氧化能力和诱导CRYAB和Hsp70的蛋白水平增加,提高H9C2心肌细胞抗热损伤的能力。为了进一步验证VC和VC-Na抗热应激损伤的作用,我们通过活体试验来探究VC和VC-Na对缓解鸡心肌细胞热应激损伤的作用及作用机制。本研究选用150只30日龄的伊莎褐蛋鸡作为试验动物,并将其随机均分为对照组(正常饮用水)、VC组(50μg/mL VC饮用水)和VC-Na组(50 μg/mL VC-Na饮用水)。在热应激前进行7 d的给药饲养,然后分别进行0h、1h、3 h、5 h和10 h的热应激处理。热应激结束后立即采集受试鸡的血清和心脏组织。通过对血清中LDH、CK、CK-MB的水平检测和组织病理学检查以确定添加VC和VC-Na对缓解心肌细胞热应激损伤的保护性作用;通过对氧化损伤指标MDA、抗氧化能力SOD和T-AOC、以及CRYAB和Hsp70表达量的检测,探究VC和VC-Na缓解热应激损伤的机制。研究结果显示,添加VC和VC-Na可以显著降低血清中心肌细胞损伤指标LDH、CK、CK-MB和MDA的水平,还可以降低热应激所导致的心肌细胞颗粒变性、空泡变性、心肌纤维断裂和坏死的程度;添加VC和VC-Na可以显著提高心肌细胞的总抗氧化能力;VC-Na还可以诱导心肌细胞在正常条件和热应激条件下CRYAB和Hsp70的高表达,VC也可以诱导心肌细胞在正常条件和热应激条件下CRYAB的高表达,以及正常条件下Hsp70的高表达。
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