烟酰胺辅酶以其广泛存在于氧化还原酶中,而广受关注。越来越多的科学研究和生产实践表明,由于在长期的进化过程中,氧化还原酶对烟酰胺辅酶I和辅酶II的严重偏爱性,为科研和生产带来了诸多的不利影响。本文以探索烟酰胺辅酶的结合规律,并寻求以改造辅酶特异性为目的,借助于计算模拟的手段展开研究。研究成果主要包括与辅酶结合有关的保守催化残基的功能探究,计算机辅助的酶对辅酶的利用从特异性依赖NADH到对NADPH兼容的改造的研究,计算机辅助的酶对辅酶的利用从特异性依赖NADPH到对NADH兼容的改造的研究等。研究的主要对象全都是来源于氧化葡萄糖酸杆菌的氧化还原酶,它们分别是Gox0644,Gox2181和Gox0502。来自氧化葡萄糖酸杆菌的氧化还原酶Gox0644属于NAD(P)依赖的醛酮还原酶超家族。研究发现,其具有保守的催化四联体Asp-Tyr-Lys-His。但是其中的Asp在催化反应中扮演的角色依然不是非常清楚。本研究以Gox0644为研究对象,基于本实验室解析的Gox0644野生型和突变型D53A的晶体结构,采用分子动力学的方法,设计了一系列对照实验,探索Asp在催化反应中可能发挥的作用。分析分子动力学轨迹的结果,本研究发现,D53A突变之后的辅酶NADPH动力学轨迹相比野生型出现了明显的构象变化。当将D53A回复突变成A53D之后,辅酶NADPH的轨迹又逐渐趋近于野生型的轨迹结果。由此,本研究认为Asp53很有可能在催化四联体中扮演着影响辅酶结合的角色。此研究结果可能会为醛酮还原酶超家族催化机理的研究提供一定的借鉴和补充。来自氧化葡萄糖酸杆菌的氧化还原酶Gox2181属于短链脱氢酶／还原酶超家族。它能够不完全氧化糖类和多元醇类,这种特质使其具有潜在的工业应用前景。Gox2181在氧化还原次级醇类或酮类反应中仅局限于利用NAD+/NADH作为辅酶因子,而在NADP+/NADPH作为辅酶时就无法显现活性。本研究提出了一种新型改造Gox2181的方法,可使得Gox2181突变体呈现出NAD+/NADH和NADP+/NADPH的双重辅酶特异性。从结构方面,通过计算模拟获得Gox2181突变的指导信息并对其稳定性通过SDM和MUpro在线服务器进行分析。接着,对Gox2181突变体和其与NADP+/NADPH的结合力采用分子动力学模拟的方法进行协调性评价。最后,得到了五个Gox2181突变体(Gox2181-D43Q, Gox2181-Q20R&D43Q, Gox2181-D43S, Gox2181-Q20K&D43S和Gox2181-Q20R&D43S)在氧化／还原次级醇类／酮类反应中都具有很高的活性,并且都能利用NAD+/NADH和NADP+/NADPH作为辅酶因子。这种新型的通过对目标蛋白的结合口袋进行计算机辅助分析进而实现辅酶结构的重组和突变诱导的方法,是一种应用前景广阔的改造目标酶的辅酶特异性从依赖NADH到对NADPH兼容的方法。来自氧化葡萄糖酸杆菌的Gox0502,是一种与黄素相关的NADPH依赖性的氧化还原酶。以其广泛的催化底物谱和严格的立体选择性催化,使其具有重要的科研和应用价值。为了实现其在科研和工业生产中的辅酶循环利用,本研究通过计算机辅助设计和定点突变的方式改造了Gox0502,使之成为可以利用NADH作为辅酶的酶。分子动力学模拟和酶活测定的结果均表明,Gox0502突变蛋白W66Q既可以利用NADPH作为辅酶,也可以利用NADH作为辅酶,且酶活相当。本研究借助于计算蛋白设计的手段,成功实现了酶的辅酶特异性从依赖NADPH到对NADH兼容的改造。通过对烟酰胺辅酶结合规律的研究,借助计算模拟的手段,本研究成功实现了酶对辅酶的利用从特异性依赖NADH到对NADPH兼容以及从特异性依赖NADPH到对NADH兼容的改造,可以为合成生物学、辅酶工程、辅酶相关的工业生产等提供有力的参考和帮助。