甲基营养型毕赤酵母是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一,该表达系统具有产量高,操作简单,表达稳定及成本低等优点。毕赤酵母还具有蛋白翻译后修饰加工系统,非常适合作为真核生物蛋白的大规模生产平台。本论文主要采用毕赤酵母系统表达人肠道病毒EV71和EB病毒(Epstein-Barr virus)疫苗候选抗原,并进一步研究候选抗原的免疫原性。EV71是手足口病的主要致病原之一,能引起儿童患者严重神经系统疾病甚至死亡。由于EV71感染性强且致病率高,EV71病毒已导致手足口病疫情多次爆发。然而目前仍缺乏有效的抗病毒药物与预防疫苗。研究表明EV71衣壳蛋白VP1具有较强的免疫原性：重组VP1能够有效诱导中和抗体产生,并保护新生小鼠免于病毒致死性感染。因此VP1蛋白是具有潜力的EV71疫苗候选抗原。EBV是常见的感染人类B细胞的γ疱疹病毒,能在95%以上人群中进行慢性潜伏感染。EBV是感染性单核细胞增多症的致病原,能够诱发淋巴及上皮肿瘤。EBV的致癌性使得EBV疫苗的研制工作尤为紧迫与必要。目前EBV治疗型疫苗研究主要集中于EBV核抗原1(EBNA1)上,而预防型疫苗则主要以EBV包膜蛋白gp350为研究重点。EBNA1是在所有EBV相关恶性肿瘤中唯一表达的病毒蛋白,并在EBV潜伏感染过程中具有重要作用。研究表明EBNA1特异T细胞能够有效杀伤EBV阳性肿瘤细胞,因此EBNA1被认为是EBV相关恶性肿瘤免疫治疗的候选抗原。gp350在病毒感染过程中具有重要作用,gp350与B淋巴细胞表面2型补体受体(CR2)结合介导病毒进入和感染靶细胞。大量研究表明gp350是中和抗体的首要靶标,为EBV预防型疫苗的首要候选抗原。本论文在毕赤酵母中成功表达了VP1, EBNA1和gp350,并取得了创新性成果,研究结果主要分为以下三个部分：1.将密码子优化EV71衣壳蛋白VP1序列插入到真核表达载体中,然后将重组表达载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达；成功获得分泌表达的重组VP1蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析法,从培养上清中分离得到纯化VP1蛋白。以小鼠为研究对象,检测重组VP1蛋白的免疫原性及抗病毒效果。实验结果显示重组VP1能够诱导小鼠产生高水平VP1特异抗体,体外中和实验证明这些抗体具有中和EV71病毒活性。新生小鼠被动保护实验进一步证实VP1疫苗的预防保护效果。此外,VP1还能刺激淋巴细胞增殖与Th1型免疫应答反应。综上所述,毕赤酵母表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,能够有效诱导抗病毒抗体产生并激活免疫系统,因此重组VP1具有开发为EV71亚单位疫苗的潜力。2.通过生物信息学分析发现EBNA1抗原表位主要位于蛋白C端结构域,因此选定EBNA1截短体(ElΔGA,390-641位氨基酸)作为EBV治疗型疫苗候选抗原。通过对ElΔGA序列密码子进行优化,构建真核表达载体,并将重组载体转化至毕赤酵母中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western杂交结果显示在毕赤酵母系统中成功表达重组ElΔGA,采用Ni-NTA亲和层析法从酵母培养上清中高效纯化ElΔGA蛋白。将纯化的ElΔGA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠以获得多克隆抗体,Western杂交结果显示小鼠多克隆抗体能够特异识别B95-8细胞裂解液中EBNA1蛋白。重组ElΔGA能够刺激T淋巴细胞增殖和Thl型免疫应答反应,同时诱导免疫小鼠脾脏和外周血中CD4+T和CD8+T细胞显著增多。这些实验结果表明毕赤酵母表达的ElΔGA具有较强免疫原性,具有开发为EBV相关恶性肿瘤候选疫苗的潜力。3.抗原表位分析发现,gp350蛋白N端结构域含有关键中和表位,具有开发为EBV候选疫苗的潜力。在毕赤酵母系统中成功表达密码子优化的gp350蛋白N端1-443位氨基酸肽段,重组蛋白可通过一步亲和层析法得到有效纯化。本研究为重组gp350蛋白大规模生产及其抗病毒活性深入研究奠定基础。在本论文中,使用毕赤酵母系统成功表达EV71和EBV疫苗候选抗原,研究结果显示重组VP1和ElΔGA能够诱导特异抗体产生,活化免疫系统,并能够刺激细胞因子分泌及淋巴细胞增殖。这些结果表明酵母表达的候选抗原具有较强的免疫原性,并具有开发为抗病毒疫苗的潜力。