本课题来源于广州市科技攻关计划(No.2006Z3-E0401和国家自然科学基金项目(No.30973421)。背景与目的慢性髓细胞白血病(CML)细胞中存在着9号和22号染色体相互易位产生的Ph染色体,形成Bcr-Abl融合基因,表达异常酪氨酸激酶活性蛋白,进而导致CML发病。根据CML这一特殊发病机制,一种Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂一伊马替尼已成功用于临床治疗。伊马替尼(IM)是目前CML-慢性期患者标准治疗方案,它能明显改善慢性期患者5年生存期并显著降低急变发生概率。尽管大多数慢性期CML患者采用IM治疗后疾病得到有效控制,但是一部分患者病情仍会反复或由慢性期向加速期、急变期进展。处于CML进展期(加速期或急变期)的患者即使采取IM作为初始治疗,大多数则会表现出对IM治疗反应不佳、耐药、病情反复。因此研究IM耐药机制已成为髓系白血病靶向治疗的最主要问题。产生IM耐药最常见原因是Abl激酶结构域发生点突变,抑制激酶与IM效应位点相结合。目前报道的其他产生耐IM作用机制,主要包括Bcr-Abl基因序列扩增、Bcr-Abl蛋白产物过表达、胞内IM浓度下降以及其他类型的酪氨酸激酶(PTKs)激活等。促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph)是最大的酪氨酸激酶受体蛋白家族。Eph活化后最主要生物学效应是调控细胞运动与形态形成。EphB4是受体Eph蛋白家族成员之一,在肿瘤形成、细胞间相互作用(包括细胞间连接、粘附、迁移和排斥)中起到重要作用。尽管髓系白血病IM耐药已经被广泛关注和研究,但很少有报道涉及Eph受体是否在产生IM耐药中起到作用。近来报道,在Ph+急性淋巴细胞白血病,EphB4过表达同IM耐药有关。本课题研究目的就是确定EphB4在髓系白血病耐IM效应中所起的作用及其机制。Ras信号通路在肿瘤细胞生长中起到必不可少的作用。Ras激酶活化后可使其下游信号蛋白磷酸化水平增高,例如MEK/ERK蛋白。目前证实在Ph染色体阳性的急性淋巴细胞白血病和CML细胞中存在一种新型IM耐药机制,由Ras/MEK/ERK活化产生的IM耐药性。为了确定在髓系白血病中,受体EphB4过表达是否参与IM耐药作用,我们将检测在改变EphB4表达情况下,Ras/MAPK通路中的蛋白磷酸化水平。Rho家族小G蛋白(RhoA, Rac1和Cdc42)具有调控细胞骨架结构的功能。Cdc42和Rac1是细胞迁移运动中最主要调控蛋白,这一作用有助于促进Bcr-Ab1活化产生增殖效应。2003年,Ohmine等证实RhoA激酶蛋白参与产生IM耐药性。本课题组前期研究工作(国家自然科学基金：30271463)应用基因表达谱芯片技术对K562细胞(CML急变细胞系)基因表达差异分析发现,RhoA在K562-W细胞中呈低表达,而在IM耐药的K562-R细胞中呈高表达。这表明RhoA在IM耐药中扮演重要角色。本项研究中,我们同步检测了改变EphB4表达情况下,RhoA通路蛋白活性水平的变化。高三尖杉酯碱(HHT)源自植物生物碱成分,过去30年间HHT广泛用于髓细胞白血病治疗。2008年Tong等研究证实,HHT具有泛酪氨酸激酶抑制剂的活性,能够阻断多条白血病细胞信号通路。在出现异常酪氨酸激酶激活的髓细胞白血病治疗中,HHT具有十分重要作用。2011年,我们评估了以HHT作为一线方案治疗老年AML(初发或继发AML)的疗效及安全性。结果证实HHT作为诱导和诱导后的一线治疗方案不仅有助于延长患者总生存期,而且较蒽环类药物更为安全可靠。2010年Fang等相关研究认为,对标准剂量IM治疗反应不佳的CML进展期患者,HHT+IM方案能够再次诱导患者获得血液学缓解,部分甚至可获得遗传学缓解。HHT通过抑制肿瘤细胞蛋白合成实现了治疗急性髓系白血病的作用,但HHT联合IM治疗进展／耐药CML机制并不十分明确。2004年本研究小组成员通过蛋白质组学分析及质谱鉴定发现,HHT作用于K562细胞后,DJ-1蛋白质表达增强。String在线软件(http://string-db. org/)分析发现,DJ-1蛋白能够抑制EphB4蛋白表达。这提示我们,HHT可能会抑制K562细胞中EphB4表达。前期实验基础中,我们检测发现EphB4高表达于K562-R细胞株,进一步建立了稳定低表达EphB4的K562-耐药细胞株(K562-R-EphB4-sh,通过ABI在线软件设计出EphB4的反义RNA寡核苷酸序列,构建慢病毒载体、转入293T细胞,直接感染K562-R细胞得到低表达EphB4的稳定细胞株)。本课题研究目标就是阐述EphB4在伊马替尼耐药中的角色及其作用机制,探索HHT是否下调EphB4效应途径的表达水平。研究方法1.细胞培养10%小牛血清RPMI-1640培养基培养K562-W(CML急变期细胞株,多探针荧光原位杂交检测显示表达Bcr-Abl融合基因)细胞。耐IM的K562-R细胞培养基内加入浓度为5.45mg/L的IM。所有细胞株均在南方医院血液科实验室培养,选取对数生长期的细胞进行实验。2.MTT测定分别取K562-W、K562-R和K562-R-EphB4-sh细胞,按0.5×104/孔浓度加于96孔培养板；100毫升培养基培养。分别在不同浓度梯度IM (0-8mg/L)孵育24小时。每孔加入5mg/ml浓度的噻唑兰(MTT)20ul,测定细胞抑制率,对照组内加入等浓度的DMSO(100ug/孔)。细胞增殖抑制率(%)=(1-(处理组-调零孔)/(对照组-调零孔))×100%。不同细胞株之间IC50比值即为细胞的相对耐药倍数。HHT作用下,IM对于K562-R细胞增殖抑制率,也用MTT法测定。3.移植物模型本研究使用BALB/C雌性裸鼠(4-5周龄,斯莱克景达实验动物有限公司)。一次性在裸鼠侧背部皮下接种K562-W.K562-R和K562-R-EphB4-sh细胞液100微升(接种细胞数量达到107)。微米卡尺测量测量肿块长短径,计算肿瘤体积=长径×短径2/2。4.半定量PCR分析取对数生长期的实验用细胞株,用Trizol分离RNA, ABI9700仪器进行半定量PCR检测。Primer5.0软件设计待扩增的引物序列。EphB4-上游引物：5’-ACTCCTTCCTGCGGCTAA-3’;EphB4-下游引物：5’-AGACGAGGTTGCTGTTGACT-3,5. Western Blot分析RIPA裂解液提取组织细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。目的蛋白采用SDS-PAGE电泳法分离、转印蛋白至PVDF膜。5%脱脂乳(或牛血清白蛋白)溶液摇床封闭2小时；5%BSA溶液稀释磷酸化蛋白一抗(1：1000),4℃过夜。主要使用的血清抗体包括：抗EphB4抗体(R&D,美国),抗磷酸化Rac1+Cdc42抗体(cst,美国),抗磷酸化RhoA抗体(cst,美国),抗磷酸化ERK1/2抗体(cst,美国),抗磷酸化MEK1/2抗体(cst,美国)和抗β-actin抗体(Santa Cruz生物公司,美国)。洗脱后,5%血清白蛋白稀释HRP-结合羊抗鼠或鼠抗羊/兔免疫球蛋白(1/5000),孵育PVDF膜1小时。再次洗脱后,使用增强发光剂显影二抗。6. PE Annexin V凋亡检测用含有7-氨基放线菌素D成分的PE Annexin V染色试剂盒检测K562-R细胞分别在HHT、IM和HHT+IM作用下的凋亡率,流式细胞仪分析检测结果。7.统计学分析数据采用SPSS10.0软件处理。全程实验重复3次,计量资料用均数±标准差描述。对比各移植瘤分组之间体积差异、不同细胞株及其移植瘤组织间蛋白磷酸化水平及其mRNA检测结果比较采用单因素方差分析。IM、HHT干预后的细胞及其移植瘤组织蛋白磷酸化表达对比,采用配对t检验。P<0.05时,差异具有统计学意义。结果1. K562-R-EphB4-sh细胞中EphB4表达水平显著下降采用半定量PCR和Western blot技术来确认不同细胞株中EphB4mRNA和蛋白的表达水平。与K562-W细胞相比,耐IM的K562-R细胞高表达EphB4受体。但在导入EphB4mRNA干扰序列的K562-R-EphB4-sh细胞中,EphB4mRNA表达水平显著低于K562-R(多重比较,P<0.001)和K562-W细胞(多重比较,P=0.006),相应的EphB4蛋白表达水平也显著低于K562-R(多重比较,P<0.001)和K562-W细胞(多重比较,P<0.001),这表明K562-R-EphB4-sh细胞株建立成功。2.K562-R-EphB4-sh细胞恢复对伊马替尼的敏感性MTT法分析K562-R-EphB4-sh细胞对IM的耐受剂量。结果显示K562-R-EphB4-sh (IC500.93mg/L)细胞对IM敏感性显著高于K562-R细胞(IC505.45mg/L,多重比较P<0.001)。随着EphB4表达下调,K562-R-EphB4-sh细胞对IM耐药性降低,但其敏感性尚未达到K562-W细胞的水平(IC500.16mg/L,多重比较P=0.013)。3.建立K562细胞裸鼠皮下移植瘤模型裸鼠皮下接种细胞后30天,移植瘤体积大小超过1000mm3。体积均值分别为K562-W移植瘤1588.78±210.89mm3, K562-R移植瘤1631.13±454.57mm3和K562-R-EphB4-sh移植瘤1710.60±266.41mm3(F=0.249, P=0.782)。剖取3组移植瘤组织进行病理学鉴定,荧光显微镜下可见K562-R-EphB4-sh组织细胞有绿色荧光反应,证实移植痛造模成功。4. K562-R-EphB4-sh细移植瘤对伊马替尼治疗敏感对比K562-W,K562-R和K562-R-EphB4-sh移植瘤成瘤体积和生存数目。移植瘤成功建立后,3组裸鼠移植瘤(N=6/组)开始口服标准剂量的IM (91ug/g体重,疗程30天)治疗。干预治疗后K562-W裸鼠移植瘤体积较治疗前显著回缩(806.15±202.31mm3对比1586.73±230.94mm3,t=12.539,P<0.001)。低表达EphB4的K562-R-EphB4-sh移植瘤体积均值较治疗前无显著差异(1630.16±412.01mmm3对比1720.06±290.54mm3, t=0.922, P=0.399)。K562-R移植瘤治疗后体积均值继续显著增加(2301.25±555.76mm3对比1733.82±399.22mm3, t=-6.452, P=0.001)。治疗终止后统计3组移植瘤裸鼠(N=6/组)死亡数目,其中K562-R移植瘤裸鼠在完成全疗程(30天)IM治疗前全部死亡(6只),K562-W移植瘤裸鼠死亡2只,K562-R-EphB4-sh移植瘤裸鼠死亡4只。从移植瘤体积和裸鼠生存数目来看,K562-R-EphB4-sh移植瘤接受口服IM治疗疗效较K562-R移植瘤更为显著。5. K562-R-EphB4-sh细胞及其移植瘤中信号蛋白的磷酸化水平在K562-W,K562-R和K562-R-EphB4-sh细胞及其移植瘤组织中,我们检测了一系列可能相关的信号蛋白活性水平(Ras/MEK/ERK和RRac1/Cdc42/RhoA通路)。在3个细胞株中,Ras-GTPase均为高表达(F=0.948,P=0.439)。K562-R和K562-R-EphB4-sh细胞中MEK和ERK信号磷酸化水平显著高于K562-W细胞(多重比较均为P<0.001)。而在K562-R细胞,Rac1+Cdc42和RhoA磷酸化水平显著高于K562-R-EphB4-sh和K562-W细胞(多重比较均为P<0.001)。移植瘤组织检测证实活性蛋白表达情况与细胞株水平一致。K562-R移植瘤组织高表达EphB4,K562-R-EphB4-sh移植瘤组织则显著低表达EphB4(多重比较P<0.001)。与K562-W移植瘤组织相比,MEK和ERK蛋白磷酸化水平在K562-R-EphB4-sh和K562-R组织均显著增高(多重比较均为P<0.001),而Rac1+Cdc42和RhoA磷酸化水平在K562-R移植瘤组织中显著高于K562-R-EphB4-sh和K562-W移植瘤组织(多重比较均为P<0.001)。6.HHT联合伊马替尼能够增强对K562-R细胞的凋亡和增殖抑制率PE Annexin V凋亡检测结果显示,在IM (1.2mg/L)作用下K562-R细胞凋亡率仅为2.35±0.11%,显著低于K562-W细胞(71.82±1.94%,多重比较P=0.001)。但在HHT (20ug/L)联合IM作用下,K562-R细胞凋亡率增加到58.71±2.39%,显著高于单独IM孵育下的K562-R细胞(多重比较,P=0.002)。我们测定K562-R细胞对于伊马替尼IC50值为5.45mg/L,在HHT20ug/L浓度干预下,K562-R细胞株对伊马替尼的IC50均值由5.45下降至1.17mg/L (t=15.271, P<0.001)。7.K562-R移植瘤裸鼠接受HHT联合IM方案治疗更有效K562-R移植瘤裸鼠分为3个治疗组(N=6/组)分别接受HHT,M和HHT+IM方案治疗。接受HHT+IM方案治疗的裸鼠移植瘤体积较治疗前显著下降(1692.82±317.14mm3对比975.56±132.42mm3, t=8.637, P<0.001)。反之,接受单一IM方案治疗的K562-R移植瘤裸鼠体积较治疗前显著增加(1733.82±399.22mm3对比2301.25±555.76mm3, t=-6.452, P=0.001)。治疗终止(4周)统计3组移植瘤裸鼠(N=6/组)死亡数目,其中伊马替尼治疗组移植瘤裸鼠在完成全疗程(4周)IM治疗前全部死亡(6只),HHT单药治疗组移植瘤裸鼠死亡5只,HHT+IM治疗组移植瘤裸鼠死亡1只。从移植瘤体积变化和裸鼠生存数目来看,HHT联合IM方案较单一使用IM或HHT的方案治疗K562-R移植瘤更加有效。8.HHT阻断EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA传导通路对于HHT干预后的K562-R细胞及其移植瘤组织,我们进行了EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA和MEK/ERK通路蛋白的检测。HHT(20ug/L)孵育后,K562-R细胞中的受体EphB4蛋白、Rac1+Cdc42和RhoA磷酸化蛋白表达显著下降(t=49.730,P<0.001和t=23.507,P=0.002和t=86.554,P<0.001),但MEK/ERK信号蛋白磷酸化水平在HHT干预前后均维持高水平表达(t=1.296,P=0.324和t=-1.147,P=0.370)。与HHT干预作用不同的是,阿霉素(1mg/L)孵育前后,EphB4(t=1.644,P=0.242), Rac1+Cdc42(t=2.203, P=0.158)和RhoA (t=-3.538, P=0.071)蛋白磷酸化均成高水平表达,阿霉素干预后没有使EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA通路表达活性下降。移植物组织蛋白测定结果与细胞检测结果一致。EphB4和磷酸化的Rac1+Cdc42、RhoA蛋白在IM治疗后的表达水平仍显著高于HHT和HHT+IM方案治疗组(多重比较均为P<0.001)。在细胞和组织中,均证实经过含有HHT方案干预治疗后,EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA蛋白表达水平较IM治疗组显著下降。结论1.采用BALB/C雌性裸鼠皮下建立K562-W, K562-R和K562-R-EphB4-sh移植瘤技术成熟、稳定可靠。2.在耐受伊马替尼的K562-R细胞中EphB4过表达。而低表达EphB4的K562-R-EphB4-sh细胞,对IM敏感性得到明显恢复。K562-R-EphB4-sh移植瘤裸鼠,接受IM治疗后其疗效明显好于K562-R移植瘤裸鼠。我们首次认定EphB4过表达是IM耐药性产生的重要因子。3.信号蛋白检测,MEK/ERK通路蛋白活性并没有随着EphB4表达下调而出现变化。MEK/ERK通路磷酸化水平在K562-R和K562-R-EphB4-sh细胞株及其移植瘤组织之间均呈高表达。MEK/ERK通路活性水平未受到EphB4蛋白表达强度变化的影响。与K562-R细胞及其移植瘤组织对比,在K562-R-EphB4-sh细胞株和移植瘤组织中,RhoA和Rac1+Cdc42磷酸化表达水平同步下降。通过细胞株及其移植瘤相关耐药信号途径检测,我们首次发现在髓细胞白血病可能存在一个新的IM耐药途径：EphB4过表达介导的Rac1/Cdc42/RhoA通路。4.HHT联合IM能够显著增力K562-R细胞凋亡率与增殖抑制率。与单药使用IM或高三尖杉酯碱相比,HHT联合IM的治疗方案能够显著缩小K562-R移植瘤体积,增加裸鼠生存数目。HHT+IM方案在K562-R移植瘤裸鼠的治疗反应较任一单药组更为有效。5.磷酸化蛋白检测结果显示,而HHT干预K562-R细胞及其移植瘤组织后,EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA通路磷酸化活性较前显著下降,HHT具有阻断IM耐药途径EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA的作用,而阿霉素对该通路活性水平则没有影响。因此从作用机制上我们首次对HHT联合IM治疗耐药髓细胞白血病,其效果明显好于IM或HHT单药治疗的原因做出理论解释。