背景与目的：乳腺癌是目前全世界女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌发病人数和死亡人数均位于女性恶性肿瘤前列,是一类严重危害女性身心健康的重大疾病。乳腺癌是一种主要影响绝经后妇女的恶性肿瘤,但是近年来乳腺癌发病逐渐呈现年轻化趋势。肿瘤流行病学研究发现年轻乳腺癌的发病率在不同种族人群中存在差异。在亚洲地区,虽然乳腺癌总体发病率较低,但是,年轻乳腺癌的发病率和所占比率却远高于西方国家。而且,亚洲乳腺癌发病高峰年龄也较西方国家提前。与非年轻乳腺癌相比,年轻乳腺癌患者的肿瘤临床TNM分期更晚,病理类型更具侵袭性,组织学分级更高,更易发生淋巴结或血行转移,恶性程度更高,术后复发率更高,ER和PR阴性率更高,HER2阳性率更高,三阴性乳腺癌比例更高,p53突变率更高,BRCA1/BRCA2携带者突变率更高。年轻乳腺癌具有独特的生物学行为,和老年乳腺癌可能是两种不同的疾病过程。国外科学家尝试从基因层面研究年轻乳腺癌的潜在生物学机制,Weber-Mangal等发现年轻乳腺癌患者基因组拷贝数增加或缺失主要位于某部分染色体；Anders等发现年轻乳腺癌患者ERα、ERβ和PR mRNA表达水平降低,HER2和EGFR mRNA表达水平增高；Pirone等发现802个基因表达水平和年龄之间呈显著性相关。但是,目前关于亚洲人年轻乳腺癌这方面的研究不多。近年来,基因芯片技术因其大规模、高通量的特点得到了广泛应用,网络公共数据库中的基因芯片表达谱数据与日俱增,这也为我们利用相关基因芯片数据进行大样本数据挖掘和分析创造了可能。本研究将年轻乳腺癌定义为年龄≤45岁乳腺癌患者,将年龄≥65岁乳腺癌患者纳入对照组,结合临床病理资料的回顾性分析以及GEO公共数据库下载的亚洲人乳腺癌基因芯片数据分析,以期初步了解亚洲人年轻乳腺癌的临床特点及潜在生物学机制,对于深入探讨亚洲人年轻乳腺癌的分子水平机制、指导年轻乳腺癌患者的个体化治疗和改善年轻乳腺癌患者的预后等具有现实的意义。材料与方法：1.研究对象1.1乳腺癌患者大样本临床资料收集2009年10月～2013年11月期间南方医科大学南方医院乳腺科收治确诊乳腺癌患者临床病历资料共1125例。所有患者均为女性,确诊时年龄为20～87岁,中位年龄46岁,平均年龄47.3岁。将年龄≤45岁乳腺癌患者纳入年轻组(实验组)；将年龄≥65岁乳腺癌患者纳入老年组(对照组)。1.2152对乳腺癌患者组织标本连续收集2012年1月～2013年8月期间接受乳腺癌改良根治术或保乳手术(术前未接受放疗、新辅助化疗等治疗)患者的癌和癌旁组织标本共152对,其中：年轻组130对；老年组22对。1.3基因表达谱数据从GEO数据库下载含年龄信息的亚洲人乳腺癌相关基因表达谱数据,登录号分别为GSE45255和GSE15852。经过年龄标准筛选后,最终共有36例年轻乳腺癌和21例老年乳腺癌组织基因芯片进入数据分析。2.研究方法2.1回顾性分析对年轻组和老年组之间的临床病理特征、免疫组化、分子分型和TNM分期等各项临床指标进行大样本回顾性分析。2.2基因表达谱数据分析在基于R语言的Bioconductor平台上读取芯片数据,数据质控后采用以Entrez基因为中心的CDF文件代替原始Affymetrix的CDF文件,对基因芯片数据重新归纳。接着,采用RMA方法进行归一化处理,采用combat算法消除两组芯片数据的批次影响。完成数据的预处理之后,进行筛选差异表达基因、聚类分析、GO (gene ontology)分析和KEGG Pathway分析等步骤。2.3实时荧光定量PCR方法采用SYBR法实时荧光定量RCR检测152对组织标本中CXCL13、GABRP、ESR1基因mRNA表达水平,以GAPDH作为内参基因校正不同样品间RNA含量的差异,用扩增倍数表示目的基因mRNA的相对量,△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因,△△Ct=△Ct-△CtAverage,扩增倍数(Fold change)=2-△△Ct。所有实验结果均重复三次。2.4Western blotting方法随机选取6对年轻乳腺癌和6对老年乳腺癌组织标本,提取总蛋白,进行Western blotting检测,以GAPDH作为内参蛋白,并进行半定量分析。2.5免疫组织化学方法随机选取48个患者的乳腺癌组织标本制作石蜡切片(年轻组,n=30；老年组,n=18),SP法免疫组化染色检测CXCL13蛋白表达情况。免疫组化结果判断标准：CXCL13染色定位于细胞浆。每张玻片在高倍镜下观察5个视野,其中没有阳性着色的为阴性(-),着色呈淡黄色的为(+),着色呈黄色的为(++),着色呈棕黄色的为(+++)。2.6分析CXCL13基因mRNA表达水平在各临床病理特征分组中的差异采用Kruskal-Wallis H检验和Mann-Whitney U检验统计分析CXCL13基因mRNA表达水平在不同临床病理特征分组之间的差异。本研究所有结果均采用SPSS20.0统计软件包进行统计分析。检验水准：a=0.05,P<0.05有统计学意义。结果：1.大样本临床资料回顾性分析结果年轻组乳腺癌患者(≤45岁)有535例,占所有乳腺癌患者的47.6%；老年组乳腺癌患者(≥65岁)有74例,占6.6%。年轻组和老年组之间在病理类型构成比上存在差异,且差异有统计学意义(P=0.001)。年轻组浸润性导管癌(非特殊型)所占比例高于老年组(85.4%VS72.9%),而特殊型浸润性导管癌所占比例低于老年组(5.1%VS18.9%)。年轻组组织学分级高于老年组,差异有统计学意义(P=0.009)。淋巴结转移阳性率在不同年龄组之间存在差异,且差异有统计学意义(P=0.035)。年轻组淋巴结转移阳性率高于老年组(45.8%VS32.4%)。年轻组ER阳性表达率低于老年组(61.9%VS74.3%),差异有统计学意义(P=0.041)。年轻组与老年组间在分子分型构成比上存在差异,且差异有统计学意义(P=0.005)。年轻组Luminal A型所占比率明显低于老年组(9.9%VS24.3%),而三阴型所占比例则高于老年组(14.9%VS8.1%)。两组之间肿瘤直径、PR阳性表达率及HER2表达强度差异无统计学意义(P=0.463、P=0.739、P=0.068)。在pT.pN.M及TNM分期上年轻组与老年组之间差异无统计学意义(P=0.284、P＝0.161、P＝1.000、P＝0.762).2.基因芯片数据分析差异表达基因筛选结果显示：共有553个差异表达基因,年轻乳腺癌有81个基因表达上调,472个基因表达下调。GO分析显示差异表达基因主要与辅因子结合、上皮细胞增殖和调节、细胞增殖能力、腺体形态发生、乳腺腺体生长发育、组织形态发生、Wnt信号通路和调节、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、信号转导和调节、信号调节、细胞通讯调节、细胞分化、细胞定位、细胞迁移和细胞死亡等59种细胞功能有关；KEGG Pathway分析显示差异表达基因主要参与的信号通路有：翻译后蛋白修饰、丁酸甲酯代谢、磷酸肌醇代谢、磷酸肌醇信号系统、Wnt信号通路、PLCβ调控、嘌呤代谢、胰岛素信号通路、血管平滑肌收缩以及钙离子信号通路。其中一类与免疫功能相关的基因如CXCL13、 IGHM、IGLL3P、IGJ和IGKC等在年轻乳腺癌中表达显著上调,CXCL13基因表达水平差异倍数最大,达2.64倍,P=7.2×10-6。3.目的基因mRNA表达水平检测CXCL13基因的mRNA表达水平在63.2%的乳腺癌组织中上调(96/152,P=0.045),在年轻乳腺癌中mRNA相对表达量明显高于老年乳腺癌(P=0.011),差异均具有统计学意义。GABRP基因的mRNA表达水平在67.8%的癌组织中下调(103/152,P<0.0001),在年轻乳腺癌中mRNA相对表达量明显高于老年乳腺癌(P=0.005),差异均具有统计学意义。ESRl基因的mRNA表达水平在53.3%的癌组织中上调(81/152,P=0.008),在年轻乳腺癌中mRNA相对表达量明显低于老年乳腺癌(P=0.009),差异均具有统计学意义。4. Western blotting检测CXCL13蛋白表达水平乳腺癌组织中的CXCL13蛋白相对表达量高于癌旁组织(P=0.015),差异有统计学意义；年轻乳腺癌的CXCL13蛋白相对表达量高于老年乳腺癌(P=0.041),差异有统计学意义。5.免疫组织化学方法检测CXCL13蛋白表达情况免疫组化检测结果显示,年轻乳腺癌CXCL13蛋白表达水平高于老年乳腺癌(P=0.015),差异有统计学意义。6. CXCL13基因mRNA表达水平在各临床病理特征分组中的分析淋巴结转移阳性组CXCL13基因mRNA表达水平高于淋巴结转移阴性组,差异有统计学意义(P=0.012)。ER阴性组CXCL13基因mRNA表达水平高于ER阳性组,差异有统计学意义(P=0.005)。结论：1.年轻乳腺癌占所有女性乳腺癌的47.6%。与老年乳腺癌相比,年轻乳腺癌病理类型更具侵袭性,组织学分级高,淋巴结转移率高,ER阳性表达率低,LuminalA型所占比例低,三阴型所占比例高。2.基因芯片数据分析结果显示,年轻乳腺癌的差异表达基因主要与腺体形态发生、乳腺腺体生长发育、Wnt信号通路和调节、细胞迁移和细胞死亡等59种细胞功能有关,KEGG Pathway分析显示差异表达基因主要参与的信号通路有：翻译后蛋白修饰、Wnt信号通路以及钙离子信号通路等。3.年轻乳腺癌中CXCL13基因表达上调,而且CXCL13基因高表达与淋巴结转移阳性、ER阴性存在相关性。年轻乳腺癌具有特殊的生物学行为,存在不同的生物学机制。CXCL13基因在年轻乳腺癌中高表达,提示与年轻乳腺癌预后不良有关,可能是年轻乳腺癌新的诊断标志物或治疗靶点,值得我们进一步研究探讨其相关功能机制。背景与目的：乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌在不同地区、不同种族之间可能存在肿瘤生物学因素的差异。基因芯片技术的广泛应用,网络公共数据库中与日俱增的基因芯片表达谱数据可提供海量的生物学数据,这为我们进行亚洲人乳腺癌基因表达情况的综合分析提供了可能。同时,多基因的异常表达是乳腺癌发生和进展的最主要的生物学因素,初步分析亚洲地区乳腺癌的差异表达基因及可能涉及的信号通路,对于深入探讨亚洲人乳腺癌的发病机制、指导乳腺癌患者的个体化治疗和改善乳腺癌患者的预后等具有现实的意义。材料与方法：1.基因表达谱数据与分析在美国生物技术信息中心GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)搜索所有亚洲人乳腺癌相关的基因芯片数据,下载符合本研究要求的数据集共5套,登录号分别为GSE6367、GSE9309、GSE15852、GSE33447和GSE45255。最终,共有318例乳腺癌组织和60例正常乳腺组织的基因芯片数据被纳入实验分析。2.组织标本收集本研究收集2013年8月-2013年9月期间在南方医科大学南方医院乳腺科接受乳腺癌改良根治术(术前未接受放疗、新辅助化疗等治疗)患者的组织标本共32对,患者均为女性,年龄为26～67岁,中位年龄48岁。3.组织标本RNA的提取与qRCR检测32对乳腺癌的癌及癌旁组织标本按照Trizol法操作步骤提取总RNA,根据反转录试剂盒说明书进行反转录。采用SYBR法实时荧光定量RCR检测组织标本中各基因mRNA表达水平,以GAPDH作为内参基因采用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达值。各个基因的表达值测量均重复进行三次。本实验结果均采用SPSS20.0统计软件包进行处理,检验水准：α=0.05,P<0.05有统计学意义。结果：1.亚洲人乳腺癌组织与正常乳腺组织之间差异表达的基因差异表达基因筛选结果显示：436个基因在乳腺癌组织出现差异表达,其中上调的有259个基因,下调的有177个基因。Pathway分析发现差异表达基因主要与脂肪酸代谢通路、脂质和脂蛋白代谢通路以及PPAR信号通路等有关。2.差异表达基因的验证荧光定量PCR检测结果显示,KRT19在乳腺癌组织中表达上调,ADIPOQ、 CFD、RBP4、LPL、ABCA8和CD36在乳腺癌组织中表达下调,差异均有统计学意义。结论：亚洲人乳腺癌主要与KRT19、ADIPOQ、CFD、RBP4、LPL、ABCA8和CD36基因相关,其中ADIPOQ、CFD、RBP4和LPL基因可能在机体代谢过程中发挥重要作用,导致乳腺癌的发生、发展和转移；CD36基因可能是亚洲人乳腺癌的特殊致病基因；ABCA8基因可能是一个新的亚洲人乳腺癌相关基因。