昆虫由于缺乏高等动物的获得性免疫系统,因此在进化过程中形成了复杂的天然免疫系统。昆虫的特有免疫系统使其在抵御病原微生物的过程中体现出了与脊椎动物较大的差异。因此,对昆虫固有免疫在分子水平上的研究不仅有利于生理和病理过程的认识,还有助于了解宿主与病原微生物相互作用的机制。蝗虫是主要农业害虫,也直翅目昆虫的代表,具有强大的防御系统,研究蝗虫免疫防卫反应机制可为设计新的害虫防治策略提供理论依据。真菌是昆虫的主要病原微生物,在调控昆虫种群中起着重要作用。昆虫病原真菌作为杀虫剂具有广泛的应用前景,例如蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)已广泛用于蝗虫防治。免疫反应是影响蝗绿僵菌杀虫速度的重要因素。因此,近年来对蝗虫免疫系统的研究逐步增加,初步了解了蝗虫免疫系统,弄清了蝗虫不同免疫组织对病原真菌免疫反应的异同。然而,缺乏蝗虫在病原真菌侵染不同阶段的免疫反应特征分析。早感知就能够早防御,迄今仍不清楚蝗虫最早开始免疫反应的时期及特征。因此,建立蝗虫不同组织在病原真菌侵入的不同时期的免疫反应的差异表达基因数据库,以弄清蝗虫免疫反应进程中的动态变化,对于理解害虫防卫病原真菌的机制和高毒力杀虫真菌菌株选育都具有十分重要的意义。本研究以东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)的主要免疫组织“脂肪体”和“血细胞”为研究材料,通过转录组测序和生物信息学分析得到了它们在蝗绿僵菌侵染不同阶段中的差异表达基因和免疫相关基因,采用RT-qPCR的方法验证早期上调表达的免疫相关基因;采用注射双链RNA的方法进一步证实了东亚飞蝗早期感知蝗绿僵菌的机制。主要的实验结果如下:(1)通过Illumina Hiseq2000测序平台进行高通量测序,获得了高质量的东亚飞蝗的免疫组织转绿组信息。在本研究得到的128988条Unigene中,长度大于1000bp的有33396条,整个Unigene的平均长度达到了920 bp。(2)首次获得了东亚飞蝗在蝗绿僵菌侵染过程中不同阶段的脂肪体和血细胞的基因表达特征。在接种蝗绿僵菌孢子后4 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h,脂肪体的差异表达基因分别为5241、6180、9921、11775、10002和10121个。其中上调表达的基因分别为722、1103、901、1476、5123和1251个,下调的基因分别为4519、5077、9020、10299、4879和8870个;血细胞的差异表达基因分别为327、1771、8279、5800、6826和6691个,其中各个时期上调表达的基因分别为193、1616、1031、1593、1406和2234个,下调基因分别为134、155、7248、4207、5420和4457个。在蝗绿僵菌侵入前(4h和12h)血细胞和脂肪体都有大量基因的差异表达;在蝗绿僵菌穿透体壁和侵染的早期(24h和36h),昆虫的免疫反应最为剧烈,脂肪体和血细胞的差异表达基因均达到最大值;在侵染的中后期,脂肪体和血细胞的差异表达基因总数趋于稳定,但下调表达基因数量较多。在全部的6个时间点,脂肪体的差异表达基因都远多于血细胞。对全部差异表达基因进行了功能注释,结果显示:脂肪体和血细胞在侵入前期的差异表达基因主要涉及到免疫相关蛋白、能量代谢、物质合成、感知系统、信号转导和环境适应性;在穿透期,除上述涉及到的功能和途径相关的基因数量增加外,新增加了细胞迁移与聚集、细胞吞噬、细胞循环相关基因以及一些对免疫反应有促进的脂肪酸代谢基因;与穿透期相比,在定殖期,新增了细胞凋亡、抗菌活性蛋白相关基因。此外,仍有许多在数据库中都未经注释的基因。(3)首次比较了东亚飞蝗两个免疫组织在不同侵染时期的免疫相关基因,通过与免疫数据库进行比对发现:在接种后4h、12h、24h、36h、48h和72h,脂肪体差异基因中涉及到免疫相关的基因分别为61,98,153,171,106和115个;血细胞差异表达基因中涉及到的免疫基因则为13、40、80、81、95和120个。在脂肪体中,早期(接种后4h、12h)的免疫相关基因主要涉及到免疫识别以及少数的信号转导和效应物;穿透期(接种后24h、36h),免疫识别和免疫信号通路转导和免疫效应因子的基因数量都大量增加;定殖期(接种后48h、72h),免疫识别和信号转导基因都有所减少,抗菌肽基因开始表达。在血细胞中,早期免疫相关基因与脂肪体相比较少,主要包括免疫识别和效应因子;在穿透期,免疫相关基因骤增,主要涉及到免疫识别、信号转导和效应因子;在定殖期,有关免疫识别和信号转导的基因与穿透期相差不大,而效应因子相关的基因则有所增加,特别是有关抗菌肽的基因。(4)采用rt-qpcr的方法验证了脂肪体和血细胞在早期(4h、12h)上调表达的57个免疫相关基因,结果显示有95%的基因(55个)与高通量测序的结果一致,其中包括酚氧化酶原系统上调表达基因(丝氨酸蛋白酶基因和ppo基因),表明本项目采用高通量测序获得的差异表达基因可靠,东亚飞蝗能在侵入前感知病原真菌。(5)通过注射双链rna的方法对酚氧化酶原系统上游的丝氨酸蛋白酶进行rna干扰发现,在进行了基因干扰后,侵染早期宿主效应相关的ppo基因的表达下调明显。这进一步说明了宿主早期确实启动了免疫防卫反应,且有可能是酚氧化酶系统在此时期起主要作用。本研究揭示了东亚飞蝗防卫其病原真菌“蝗绿僵菌”的基因表达特征。东亚飞蝗应对病原真菌的策略因侵染时期而发生变化;脂肪体与血细胞在防卫病原真菌侵入中既相互协同又具有不同的功能,在防卫反应的全过程中脂肪体的差异基因数量都远多于血细胞;东亚飞蝗能在蝗绿僵菌侵入过程中通过多种途径对其进行感知,其中酚氧化酶原系统是东亚飞蝗早期感知的重要途径。