第一部分漆树酸通过抑制组蛋白H3K9ac乙酰化改善PE诱导的心肌细胞肥大目的:探讨漆树酸(AA)改善苯肾上腺素(PE)诱导小鼠心肌细胞肥大的组蛋白乙酰化调控作用。方法:原代培养新生3天内昆明小鼠心肌细胞,按照随机数字表法将实验分为4组:Blank组;Vehicle组(PE 100μmol/L+等体积DMSO);PE组(PE 100μmol/L);AA组(PE 100μmol/L+AA 50μmol/L)。收集处理后48小时小鼠心肌细胞进行如下检测:(1)比色法检测组蛋白乙酰化酶(HATs)活性;(2)免疫印迹技术(WB)检测脑尿钠肽(BNP)、心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)、P300/CBP辅助因子(PCAF)、E1A结合蛋白(P300)、总JNK(T-JNK),磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达水平(3)实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测心肌细胞增强因子-2A(MEF-2A)的mRNA表达水平;(4)免疫荧光染色检测小鼠心肌细胞表面积。结果:(1)比色法结果显示,PE组心肌细胞的HATs活性显聚高于Blank组(P<0.05),AA组HATs活性较PE组显著降低(P<0.05),Vehicle组较PE组无显著变化(P>0.05)。(2)WB结果显示,与Blank组相比,PE组心肌细胞p-JNK磷酸化水平及组蛋白H3K9ac乙酰化水平均显著升高(均P<0.05),且心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC和HATs亚型PCAF、P300的蛋白表达水平在PE组也显著高于Blank组(均P<0.05)。与PE组比较,AA组p-JNK磷酸化水平及组蛋白H3K9ac乙酰化水平均显著降低(均P<0.05),而Vehicle组p-JNK磷酸化水平和组蛋白H3K9ac乙酰化水平较PE组无明显变化(均P>0.05),同时,AA组心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC和HATs亚型PCAF、P300的蛋白表达水平较PE组明显下调(均P<0.05),而Vehicle组较PE组无显著差异(均P>0.05)。(3)Real-Time PCR结果显示,心脏核心转录因子MEF-2A的mRNA表达水平在PE组显著高于Blank组(P<0.05),而AA能够显著下调PE干预的心肌细胞心脏核心转录因子MEF-2A的mRNA表达水平(P<0.05),Vehicle组较PE组无显著变化(P>0.05)。(4)免疫荧光染色结果显示,与Blank组相比,PE组小鼠心肌细胞表面积显著增大(P<0.05),而经AA干预后心肌细胞表面积较PE组显著减小(P<0.05),Vehicle组较PE组无显著差异(均P>0.05)。结论:(1)HATs亚型PCAF及P300介导的组蛋白H3K9ac乙酰化可能参与了PE诱导的小鼠心肌细胞肥大。(2)HATs抑制剂AA能够通过抑制PCAF及P300介导的组蛋白H3K9ac乙酰化来调控心肌细胞肥大相关基因的表达继而改善PE诱导的小鼠心肌细胞肥大。第二部分JNK/MAPK信号通路介导的组蛋白乙酰化修饰在漆树酸改善PE诱导的心肌细胞肥大中的作用目的:探讨JNK丝裂原活化蛋白激酶(JNK/MAPK)信号通路在组蛋白乙酰化酶(HATs)抑制剂漆树酸(AA)改善苯肾上腺素(PE)诱导心肌细胞肥大中的作用。方法:原代培养新生3天内昆明小鼠心肌细胞,按照随机数字表法将实验分为6组:Blank组;Vehicle组(PE 100μmol/L+等体积DMSO);PE组(PE 100μmol/L);AA组(PE 100μmol/L+AA 50μmol/L);AA+SP组(PE 100μmol/L+AA 50μmol/L+SP600125 20μmol/L);SP组(PE 100μmol/L+SP600125 20μmol/L)。收集处理后48小时小鼠心肌细胞进行如下检测:(1)免疫印迹技术(WB)检测脑尿钠肽(BNP)、心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)、P300/CBP辅助因子(PCAF)、E1A结合蛋白(EP300)、总JNK(T-JNK),磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达水平;(2)免疫共沉淀(Co-IP)检测p-JNK与HATs亚型P300、PCAF及组蛋白H3K9ac蛋白之间的相互作用关系;(3)实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测心肌细胞增强因子2A(MEF-2A)的m RNA表达水平;(4)染色质免疫沉淀技术(Ch IP)检测MEF-2A与HATs亚型P300、PCAF及心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC相互作用关系;(5)免疫荧光染色检测组蛋白H3K9ac乙酰化水平及HATs亚型P300、PCAF表达水平,并测量小鼠心肌细胞表面积;(6)Flou-3/AM荧光染色检测心肌细胞内[Ca2+]i。结果:(1)WB结果显示,与Blank组相比,PE组心肌细胞中p-JNK的磷酸化水平及组蛋白H3K9ac乙酰化水平显著升高(均P<0.05),且心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC和HATs亚型PCAF、P300的蛋白表达水平在PE组也显著高于Blank组(均P<0.05)。与PE组比较,AA组及SP组p-JNK磷酸化水平及组蛋白H3K9ac乙酰化水平均显著降低(均P<0.05),而Vehicle组p-JNK磷酸化水平和组蛋白H3K9ac乙酰化水平较PE组无明显变化(均P>0.05),同时,AA组和SP组心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC和HATs亚型PCAF、P300的蛋白表达水平较PE组均明显下调(均P<0.05),而Vehicle组较PE组无显著差异(均P>0.05)。(2)Co-IP结果显示,p-JNK可特异性地将P300、PCAF、H3K9ac共沉淀下来。(3)Real-Time PCR结果显示,心脏核心转录因子MEF-2A的m RNA表达水平在PE组显著高于Blank组(P<0.05),而AA和JNK抑制剂SP600125均能够显著下调PE干预的心肌细胞心脏核心转录因子MEF-2A的m RNA表达水平(均P<0.05),Vehicle组较PE组无显著变化(P>0.05)。(4)Ch IP结果显示,HATs亚型P300、PCAF能与心脏核心转录因子MEF-2A启动子区域结合,而心脏核心转录因子MEF-2A能够结合到心肌细胞肥大标志物基因ANP、BNP、β-MHC启动子区域。(5)免疫荧光染色结果显示,组蛋白H3K9ac乙酰化水平及HATs亚型P300、PCAF表达水平在PE组均明显高于Blank组(均P<0.05),然而与PE组比较,AA组及SP组H3K9ac乙酰化水平及HATs亚型P300、PCAF表达水平均显著降低(均P<0.05),同时也观察到与Blank组相比PE组心肌细胞表面积显著增大(P<0.05),而经SP600125和AA干预后均能显著降低PE诱导的心肌细胞肥大(均P<0.05),Vehicle组较PE组无显著变化(P>0.05)。(6)FLou-3/AM染色结果显示,与Blank组相比,PE组心肌细胞内Ca2+浓度显著升高(P<0.05),与PE组比较,AA组及SP组可以明显抑制PE诱导的细胞内Ca2+浓度升高(均P<0.05),Vehicle组较PE组无显著变化(P>0.05)。结论:(1)AA能改善PE诱导的小鼠心肌细胞肥大。(2)JNK/MAPK信号通路介导的组蛋白乙酰化修饰参与了AA改善PE诱导的小鼠心肌细胞肥大。