褐飞虱唾液蛋白功能及唾液腺在水稻齿叶矮缩病毒传播中的作用机制研究

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褐飞虱(Nilaparvata lugens)是专门取食水稻汁液的刺吸式口器昆虫,它在取食过程中由唾液腺分泌两种唾液:胶状唾液与水状唾液。刺吸式口器昆虫的唾液可起帮助昆虫取食、抑制植物防御反应、润滑和保护口针等作用。然而褐飞虱唾液蛋白组分及它们在昆虫-植物互作中的作用仍然未知。此外,半翅目昆虫是植物病毒的主要传播媒介,而唾液腺作为植物病毒在昆虫体内循环的最后场所,病毒在腺组织中的增殖方式及释放途径仍有待进一步揭示。本研究通过基因组、转录组、蛋白组等手段分析飞虱唾液腺和唾液蛋白组分,并对唾液腺在水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)传播中的功能进行深入研究。所取得的主要结论如下:  (1)利用高通量测序技术分别获得褐飞虱、灰飞虱和白背飞虱的唾液腺转录组,发现与能量代谢、蛋白合成、翻译后修饰等功能相关的基因在唾液腺中高表达。与褐飞虱(单食性)相比,灰飞虱和白背飞虱(寡食性)的唾液腺转录组中有更多同源基因,这可能与昆虫的食性相关。寡食性昆虫的OBP、P450、GST等基因发生扩张,而CSP基因发生收缩。  (2)利用LC-MS/MS,分别鉴定了50个水状唾液蛋白和16个胶状唾液蛋白,这些蛋白主要在褐飞虱唾液腺和肠道特异表达。通过RNA干扰,我们发现annexin-like-5、carbonic anhydrase、salivap-3、salivap-4(NlShp)显著影响褐飞虱的存活率。其中,annexin-like与其他昆虫的annexin结构和表达模式存在显著差异,可能是褐飞虱在长期进化中形成的,干扰annexin-like-5影响昆虫在木质部和韧皮部取食;salivap-3和salivap-4是唾液鞘形成的关键基因,salivap-4表达抑制后褐飞虱无法在水稻上正常取食,但不影响它在人工饲料上取食。  (3)唾液蛋白NlMul与褐飞虱在水稻上的适应能力相关,水稻抗性品种(ASD7)能够诱导NlMul表达。通过RNA干扰,我们发现抑制NlMul表达会导致褐飞虱唾液鞘分泌量变少,发育历期延长,并且显著降低褐飞虱在ASD7上的存活率,但不影响昆虫在TN1上生存。这种适应能力差异可能与NlMul对抗植物防御反应功能相关。  (4) RRSV侵染会诱导褐飞虱唾液腺主腺和导管部分细胞发生凋亡,并且细胞凋亡与病毒侵染同时发生。通过抑制caspase-1和caspase-Nc表达,可阻断病毒侵染引起的细胞凋亡;但caspase-8对细胞凋亡没有显著影响。抑制褐飞虱细胞凋亡不影响RRSV在唾液腺内的增殖与积累,但显著降低了RRSV从昆虫向水稻传播的效率。RRSV诱导褐飞虱唾液腺部分细胞发生凋亡是病毒从唾液腺释放的一种机制。  (5)通过酵母双杂交、GST-Pull down、透射电镜、免疫组化等技术,发现RRSV Pns10蛋白与褐飞虱的NlOSCP蛋白在唾液腺发生互作。RRSV在侵染褐飞虱后会通过这种互作关系靠近宿主的能量工厂—线粒体。抑制NlOSCP表达影响昆虫体内ATP浓度,并且使得RRSV在宿主体内的积累量显著降低。
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