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禽类与哺乳动物均属于遗传性别决定,但与哺乳动物不同,禽类的性别决定机制还不确定,上游性别决定因子还有待于进一步探寻。研究表明在转录后起重要调控作用的miRNAs在动物性腺发育过程有重要作用,本课题组拟从miRNA水平寻找与鸡性别决定及早期性腺发育相关的上游调控因子。miR-2954是位于禽类Z染色体上的miRNA,本课题组前期研究发现其在雄性性腺及其他组织中的表达量显著高于雌性,与先前报道的在其他禽类中的研究结果相似,这提示了miR-2954可能作为一个细胞自主决定因子在鸡早期性别决定及性腺发育中起调控作用。本研究首先构建了miR-2954超表达载体,并结合基因的双荧光素酶报告系统验证了miR-2954与性腺发育及功能相关靶基因的调控关系,为进一步确定及研究miR-2954在鸡早期性腺发育中的功能奠定基础。本研究的实验结果如下:1.制备了不同性别原代鸡胚成纤维细胞(CEF),通过定量PCR检测miR-2954在不同CEF细胞及商品化DF1细胞中的表达量,结果显示miR-2954在雄性CEF细胞中的表达量最高,并极显著地高于雌性和混样(雌雄等量混合)CEF及商品化DF1细胞,这与miR-2954雄性高表达特性相符;且结果表明本室的商业化DF1细胞适用于后续的miR-2954超表达载体效果检测及靶基因验证研究。2.构建了PSIN-2954、PSIN-eGFP-2954和PSIN-eGFP三种表达载体,通过序列测定和转染细胞后荧光观察初步确定其效果。定量PCR检测结果显示miR-2954在转染了PSIN-2954和PSIN-eGFP-2954载体的细胞中表达量均显著提高,这表明miR-2954超表达载体构建成功。3.转染PSIN-2954载体后通过PI染色法检测mi R-2954对DF1细胞周期的影响。结果显示:转染miR-2954组G1期的细胞比例呈极显著降低,而S期和G2期的细胞则极显著升高,这表明miR-2954的超表达可促进细胞增殖。4.根据鸡转录组的mRNA(包括5’UTR、CDS和3’UTR)与miR-2954序列的匹配情况与功能分析,筛选出四个与鸡性腺发育及功能相关的基因AMH、DMRT1、SF1及VLDL作为miR-2954的候选靶基因,并成功的构建了靶序列的荧光素酶报告重组载体。5.候选靶基因(AMH、DMRT1、SF1和VLDL)的双荧光素酶报告系统检测结果显示,miR-2954可显著或极显著地降低SF1和VLDL-CDS双荧光素酶的活性,而AMH和DMRT1-CDS双荧光素酶活性无明显变化。结果表明SF1和VLDL是与miR-2954存在负调控关系的靶基因。综上所述,本研究结果初步确定了miR-2954与SF1等早期性腺发育有关因子的调控关系,并成功构建了miR-2954的超表达载体,为接下来在鸡胚中研究miR-2954对早期性腺分化及发育的功能奠定了重要基础。