短蛸（Octopus ocellatus）,隶属于软体动物门、头足纲、八腕目、蛸科、蛸属,是我国主要的人工养殖和增殖放流品种之一。近年来由于病害的影响,短蛸养殖业受到了很大的挑战。短蛸属于无脊椎动物,本身缺乏特异性免疫,只能依靠先天免疫屏障抵御病害。Toll样受体在识别和清除病原微生物中起着重要作用。为探究短蛸Toll样受体的功能以及其信号转导过程,更好地了解短蛸先天免疫机制,本研究从转录组中得到了短蛸TLR2、TLR4和TLR6三个基因序列,借助实时荧光定量PCR手段分析了3个TLR基因在正常短蛸体内不同组织中的相对表达量以及鳗弧菌侵染后不同时间点白体和血细胞中的相对表达情况;构建了真核表达载体并检测TLR2和TLR6在HeLa细胞内的定位;还进行TLR通路相关接头分子（MyD88和TRAF6）以及下游转录因子NF-?B家族成员的表达研究。结果显示:TLR2、TLR4、TLR6的cDNA全长分别为3014bp;1717bp和3988bp,含有2112bp;891bp和3363bp的开放阅读框,分别编码703,296和1120个氨基酸。TLR2、TLR4、TLR6的蛋白质都具有一个N端的信号肽,几条重复的LRR序列、一个保守的TIR结构域和一个跨膜区域。多序列比对表明TLR2、4、6分别于真蛸、双斑蛸和中国真蛸的同源性最高,系统进化树显示它们都和头足类以及其他无脊椎动物聚为一支。TLR基因在健康短蛸各个组织中都有一定的表达。其中在短蛸白体中表达量均最高,在血细胞中也有较高的表达。鳗弧菌刺激后,TLR基因会被细菌诱导表达,在白体和血细胞中TLR表达量分别在12h和24h显著上调。亚细胞定位结果表明,TLR2和TLR6都定位于细胞的细胞质和细胞膜中,属于跨膜蛋白。原核表达结果显示,TLR2和TLR6蛋白成功诱导,条带清晰,可用于后续实验。MyD88开放阅读框共1035bp,编码344个氨基酸;包含1个N端死亡结构域和1个C端TIR结构域,不含信号肽,没有跨膜区域。TRAF6基因的开放阅读框共2633bp,编码569个氨基酸;包含1个N端的RING结构域、2个锌指结构、1个C端的环-环α螺旋结构以及TRAF同源结构域MATH。系统进化树显示MyD88和TRAF6都分别与无脊椎动物头足类聚为一支;MyD88和TRAF6在健康短蛸各组织中都有一定的表达,在白体、鳃以及血细胞中表达量较高;鳗弧菌刺激后,白体和血细胞中MyD88表达量分别在12h和24h显著持续上调,在白体和血细胞中TRAF6表达量在12h和24h显著上调,之后又有所下调。P105开放阅读框共2337bp,编码778个氨基酸,包含1个N端的RHD结构域、一个IPT结构域、多个ANK锚蛋白序列以及一个C端的死亡结构域。P65开放阅读框为1494bp,编码497个氨基酸,包含1个N端的RHD结构域和1个C端的IPT结构域。系统进化树显示,短蛸P105和P65基因均与头足类聚为一支;荧光定量PCR结果显示,P105和P65在短蛸白体、血细胞以及皮肤肌肉中表达量较高。鳗弧菌刺激后,白体中的mRNA表达量在24h显著上调。综上所述,本研究从短蛸转录组中得到3个TLR基因、信号通路相关接头分子（MyD88和TRAF6）以及下游转录因子NF-κB家族成员（P105和P65）的序列,分析了它们在正常短蛸各组织以及鳗弧菌刺激后主要免疫组织的相对表达量,并鉴定了TLR2和TLR6在HeLa细胞中的定位情况。结果表明这些基因均参与了短蛸免疫应答反应。研究结果为后续深入研究短蛸TLR基因功能以及TLR信号通路奠定了基础。