本文从以下两章进行探讨：　　第一章 天然活性产物FST6调节糖脂代谢作用机制研究　　目的:代谢性疾病是继肿瘤后威胁人类健康的最重要的疾病之一，具有一系列的代谢异常表现，包括胰岛素抵抗、高血糖、动脉粥样硬化性血脂障碍、向心性肥胖以及高血压等，寻找新的对应策略和药物作用靶点、开发新型治疗药物迫在眉睫。天然产物在药物的研发过程中一直占住重要地位，寻找和发现结构新颖、作用效果显著的先导化合物无疑将给患者带来新的希望。11β-HSD1是糖皮质激素转活酶，主要表达于肝脏与脂肪组织中，是目前糖尿病治疗药物开发的重要靶点之一，其选择性抑制剂对机体糖脂代谢以及胰岛素敏感性具有重要调控作用。化合物FST6是本课题组前期筛选得到的具有11β-HSD1选择性抑制活性的天然产物，此外，FST6能显著增加小鼠骨骼肌C2C12细胞的AMPK磷酸化水平。本论文拟在细胞、组织和动物水平上系统的研究FST6通过多个靶点发挥其对糖脂代谢的调控作用，为该化合物的进一步研究和开发提供一定的实验依据。　　方法:(1)在分子模型及细胞水平上，应用液闪接近技术(scintillationproximity assay，SPA)测定FST6对11β-HSD1活性的影响;(2)在细胞水平上，采用3T3-L1脂肪细胞，观察FST6对活性和非活性形式糖皮质激素诱导的细胞分化、葡萄糖摄取、脂肪水解及相关信号通路的影响;观察FST6对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取、脂肪酸分解、脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂联素分泌、脂代谢相关基因表达水平、AMPK及PKA信号通路关键蛋白磷酸化水平的影响;同时应用抑制剂研究FST6对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢功能调节与AMPK信号通路的相关性。(3)在整体动物水平上，观察FST6单次给药对C57BL/6J小鼠以及2型糖尿病ob/ob小鼠肝脏和肠系膜脂肪11β-HSD1活性、AMPK以及ACC蛋白磷酸化水平的影响;观察FST6长期给药对糖皮质激素诱导的C57BL/6J小鼠胰岛素抵抗的作用;并采用间接量热法观察FST6给药后对2型糖尿病ob/ob小鼠呼吸代谢的影响。　　结果:(1)在分子模型和3T3-L1脂肪细胞中，FST6可显著抑制11β-HSD1的活性，并具有良好的选择性;FST6单次给药显著抑制C57BL/6J小鼠以及2型糖尿病ob/ob小鼠肝脏和肠系膜脂肪中11β-HSD1活性;(2)FST6显著增加3T3-L1脂肪细胞中AMPK及ACC蛋白磷酸化水平，且单次给药后增加C57BL/6J小鼠及2型糖尿病ob/ob小鼠肝脏和肠系膜脂肪中AMPK及ACC蛋白磷酸化水平，提示FST6具有AMPK激动活性;(3)FST6显著抑制活性及非活性糖皮质激素诱导的3T3-L1细胞的分化，并降低细胞内甘油三酯的累积，但FST6对非活性糖皮质激素诱导的3T3-L1细胞分化的抑制作用显著强于活性糖皮质激素，提示FST6对非活性糖皮质激素诱导3T3-L1细胞分化的抑制作用可能与其11β-HSD1抑制活性相关;低剂量FST6(2.5μM)显著改善非活性形式糖皮质激素诱导的胰岛素刺激的3T3-L1细胞葡萄糖摄取的降低，而对活性形式糖皮质激素诱导的胰岛素刺激的葡萄糖摄取的降低没有显著影响，提示FST6通过抑制11β-HSD1的活性改善非活性糖皮质激素诱导的胰岛素抵抗;FST6显著抑制活性与非活性形式糖皮质激素诱导的3T3-L1细胞脂肪水解的增加，并具有明显剂量效应，但该作用与其对11β-HSD1的抑制活性无关;(4)FST6显著增加3T3-L1脂肪细胞基础状态下葡萄糖摄取，但该作用不依赖于AMPK的活化;FST6显著抑制基础状态下以及异丙肾上腺素刺激的脂肪水解，该作用不依赖于AMPK的活化，与其下调ATGL和HSL的基因表达、抑制HSL(Ser563)磷酸化水平有关;FST6显著抑制3T3-L1脂肪细胞的脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化，并降低细胞内甘油三酯累积，对脂肪酸合成的抑制作用依赖于其对脂生成基因的下调，而对脂肪酸氧化的调控依赖于AMPK的活化;(5)FST6长期处理显著降低细胞内总脂联素的蛋白水平，但增加分泌进入培液中的总脂联素水平，并促进脂联素的多聚化，且该作用不依赖于其对AMPK的活化;(6)FST6长期给药显著改善非活性形式糖皮质激素诱导的C57BL/6J小鼠的胰岛素抵抗，而对活性形式糖皮质诱导的胰岛素抵抗无改善作用，提示FST6具有体内11β-HSD1抑制活性;FST6单次给药显著降低2型糖尿病ob/ob小鼠的呼吸交换率（respiratory exchange ratio，RER）及食物摄取，对氧气消耗及二氧化碳的呼出无明显影响。　　结论:FST6具有选择性抑制11β-HSD1和激动AMPK的双重活性，可促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取和脂肪酸氧化，抑制脂解、脂肪酸生成和细胞内甘油三酯累积，并可显著降低2型糖尿病ob/ob小鼠的呼吸交换率，长期给药后可改善糖皮质激素诱导的C57BL/6J小鼠的胰岛素抵抗，这些作用与FST6抑制11β-HSD1和激动AMPK的双重活性以及下调脂解和脂生成相关基因表达有关。FST6的发现为多靶点抗糖尿病新药的研发提供了先导化合物，其作用机理研究也为新型抗糖尿病药物的研究提供了新思路。　　第二章 白藜芦醇类似物yhhu981调节脂代谢作用机制研究　　目的:SIRT1是β-NAD+依赖的脱乙酰基酶，与多种细胞生物学功能密切相关。白藜芦醇是第一个被发现具有SIRT1激动活性的多酚类小分子化合物，并具有抗氧化、延缓衰老、抗糖尿病以及心血管疾病等效应，然而白藜芦醇在体内具有生物利用低、代谢速度快、血药浓度低等不足。因此，对白藜芦醇进行结构改造和优化，增加其生物利用度与活性，将为白藜芦醇类似物的构效关系研究提供参考。本课题前期构建了SIRT1激动剂体外筛选模型，并进行化合物筛选，后续研究表明该模型在底物荧光基团的选择以及对受试化合物的结构特性方面存在争议。因此，我们放弃采用该模型继续进行化合物筛选，转而采用骨骼肌细胞对白藜芦醇类似物的游离脂肪酸氧化活性进行筛选，得到化合物yhhu981具有显著促进骨骼肌细胞游离脂肪酸氧化的作用，在此基础上揭示其调节脂代谢的作用机制，并进一步在2型糖尿病ob/ob小鼠上评价其改善脂代谢的作用，为白藜芦醇类似物的开发提供一定的实验依据。　　方法:(1)采用PCR克隆全长SIRT1基因，构建重组质粒，转化Rosetta，表达纯化目的蛋白，测定酶活，建立分子水平SIRT1激动剂筛选模型并进行化合物筛选;(2)采用骨骼肌C2C12细胞，测定白藜芦醇类似物对其游离脂肪酸氧化的影响，并应用MTT实验评价具有促进游离脂肪酸氧化的小分子化合物的细胞毒性，得到化合物yhhu981;(3)在骨骼肌C2C12细胞中，观察yhhu981对脂肪酸氧化、AMPK和ACC蛋白磷酸化、基因表达的影响，并应用AMPK抑制剂compound C、CaMKK抑制剂STO609及SIRT1抑制剂EX527等研究yhhu981对C2C12细胞脂代谢的调节信号通路的关系;(4)在HepG2肝细胞中，观察yhhu981对游离脂肪酸氧化、脂肪合成、AMPK和ACC蛋白磷酸化及基因表达的影响，并应用AMPK抑制剂compound C观察yhhu981对脂肪合成的调节与AMPK信号通路的关系;(5)在2型糖尿病ob/ob小鼠上评价yhhu981对其呼吸代谢以及糖脂代谢紊乱的影响。　　结果:(1)构建了SIRT1激动剂体外筛选模型，并对部分化合物进行了SIRT1激动活性的筛选，得到部分具有SIRT1激动活性的小分子化合物;(2)应用骨骼肌细胞对白藜芦醇类似物游离脂肪酸氧化活性进行筛选，得到小分子化合物yhhu981具有显著的促游离脂肪酸氧化活性;(3)yhhu981显著增加C2C12细胞的游离脂肪酸氧化，并促进AMPK与ACC的蛋白磷酸化水平;AMPK抑制剂compound C与CaMKK抑制剂STO609显著抑制yhhu981促进的AMPK及ACC的蛋白磷酸化以及游离脂肪酸氧化，SIRT1抑制剂显著抑制yhhu981介导的游离脂肪酸氧化;yhhu981显著上调C2C12细胞中MCAD，PGC-1α及SIRT1等与脂肪酸氧化相关基因的表达水平;(4)yhhu981剂量依赖的增加HepG2肝细胞的脂肪酸氧化，并促进AMPK及ACC的蛋白磷酸化水平;yhhu981剂量依赖的抑制HepG2肝细胞脂肪酸合成，AMPK抑制剂compound C可以逆转这种效应;yhhu981下调HepG2肝细胞中SREBP1、LDLR等与脂肪合成相关基因的表达水平;(5)yhhu981单次给药显著降低2型糖尿病ob/ob小鼠呼吸交换率(RER);yhhu981长期给药显著降低2型糖尿病ob/ob小鼠血清中游离脂肪酸的水平以及骨骼肌中甘油三酯的累积，增加肝脏中AMPK及ACC的蛋白磷酸化水平，肝脏中甘油三酯的水平也呈现下降趋势。　　结论:白藜芦醇类似物yhhu981具有显著增加C2C12细胞游离脂肪酸氧化、抑制HepG2肝细胞脂肪酸生成的作用，这种作用可能与yhhu981增加AMPK和（或）SIRT1活性、上调脂肪酸氧化以及下调脂肪酸生成相关基因表达水平有关;yhhu981单次给药降低2型糖尿病ob/ob小鼠呼吸交换率、长期给药改善ob/ob小鼠的脂代谢，这些研究为基于yhhu981的调节脂代谢先导化合物的开发提供了一定的实验依据。