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目的:观察新生大鼠镉暴露后,卵巢卵泡形态与功能的变化,了解镉对卵泡发育基因SCF/C-KIT的表达及其DNA甲基化模式的变化情况,探讨镉暴露对新生大鼠卵巢发育的影响及SCF/C-KIT在此过程中的作用。研究内容及方法:4日龄SD大鼠卵巢取出后,在DMEM/F12与α-MEM混合培养体系中进行本次实验的体外研究。染毒4d后,取卵巢组织或培养液进行相关指标的检测。1.镉对卵巢卵泡生长发育、功能的影响:培养体系中加入镉,设5个剂量组,分别为0(control)、0.5、5、10、50μM。染毒结束后,取卵巢固定、包埋、切片,HE染色,光学显微镜下计数各级卵泡数量、测量卵母细胞直径;采用免疫组织化学方法检测颗粒细胞PCNA蛋白表达情况;用RIA/ELISA方法检测培养液中E2、P4含量。2.镉对卵巢SCF/C-KIT表达的影响:培养体系中加入镉,设5个剂量组,分别为0(control)、0.5、5、10、50μM,培养结束后,提卵巢组织RNA,采用RT-PCR检测SCF和C-KIT的mRNA水平;提取卵巢组织蛋白,应用Western-blot法检测两者蛋白水平。3.外源性SCF的干预实验:(1)直接加入SCF:设control、100ng/mL SCF组;(2)加入Cd、SCF:设control、10μM Cd、10μM Cd+100ng/mL SCF组;(3)加入Cd、SCF、ACK-2的变化:设3个处理组,分别为control、10μM Cd、10μM Cd+100ng/mL SCF+2μg/mL ACK-2。染毒结束后,取卵巢固定、包埋、切片,HE染色,计数各级卵泡数量、测量卵母细胞直径、检测细胞PCNA蛋白表达情况、检测培养液中E2、P4含量。4.镉对卵巢表达DNMTs的影响:培养体系中加入镉、5-aza-CdR,设以下5个处理组:control、0.5μM Cd、10μM Cd、50μM Cd、5μM 5-aza-CdR、10μM Cd+5μM5-aza-CdR。提取卵巢RNA和蛋白,分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测DNMTs的mRNA和蛋白水平。5.镉对卵巢SCF/C-KIT基因启动子区DNA甲基化的影响:培养体系中加入镉,设5个剂量组,分别为0(control)、0.5、5、10、50μM。提取卵巢全基因组DNA,经重亚硫酸盐处理后,结合碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF-MS检测原理,分析SCF/C-KIT基因启动子区DNA甲基化情况。结果:1.镉对卵巢卵泡构成比、卵母细胞直径、颗粒细胞增殖及激素分泌的影响:光学显微镜下可观察到,50μM组的卵巢组织结构异常,卵泡轮廓不规则,颗粒细胞松散,卵母细胞变性、萎缩,故此剂量组的卵巢组织不进行卵泡计数和卵母细胞直径的测量。其余各组卵巢组织形态正常,可见大量的原始卵泡和生长卵泡。(1)卵泡构成比:与对照组相比,10μM组原始卵泡构成比升高(P<0.05);其余各组原始卵泡构成比均无明显变化(P>0.05);(2)卵母细胞直径:与对照组相比,0.5μM组原始卵泡和生长卵泡中卵母细胞直径明显增大(P<0.01);5μM组生长卵泡中卵母细胞直径增大(P<0.05),而原始卵泡卵母细胞直径无明显差异(P>0.05);10μM组原始卵泡和生长卵泡中卵母细胞直径则显著减小(P<0.01);(3)PCNA阳性率:与对照组相比,0.5μM组的卵巢颗粒细胞PCNA阳性率显著增加(P<0.01),其他各剂量组PCNA阳性率显著减少(P<0.01);(4)E2水平:与对照组相比,10μM、50μM组培养液中E2水平明显降低(分别为P<0.05,P<0.01);(5)P4水平:与对照组相比,各个剂量组间P4水平无明显变化(P>0.05)。2.镉对卵巢表达SCF/C-KIT的影响:(1)与对照组相比,SCF mRNA表达水平在0.5μM组显著升高(P<0.01),在10μM、50μM组则显著降低(P<0.01);SCF蛋白表达水平与mRNA表达一致,在0.5μM组显著升高(P<0.01),10μM、50μM剂量组显著降低(P<0.01);(2)与对照组相比,C-KIT mRNA表达水平在0.5μM组显著升高(P<0.01),在10μM、50μM组显著降低(P<0.01);C-KIT蛋白水平在0.5μM组显著升高(P<0.01),而10μM、50μM组明显降低(P<0.01)。3.外源性SCF的干预实验:(1)单独加入SCF的变化:与对照组比较,SCF组卵巢生长卵泡构成比显著增加(P<0.01);原始卵泡和生长卵泡中的卵母细胞直径显著增大(P<0.01);PNCA阳性率增加(P<0.05);E2水平显著提高(P<0.01);P4水平无明显差异(P>0.05);(2)加入Cd、SCF的变化:与对照组比较,Cd+SCF组原始卵泡构成比、卵母细胞直径、PCNA阳性率、E2、P4水平均无明显变化,不具有统计学差异(P>0.05);与Cd组比较,Cd+SCF组卵巢原始卵泡构成比显著增加(P<0.01);原始卵泡和生长卵泡中卵母细胞的直径明显增大(均为P<0.01);PNCA阳性率明显增加(P<0.01);E2水平显著提高(P<0.01),P4水平无明显变化(P>0.05);(3)加入Cd、SCF、ACK-2的变化:与Cd组比较,Cd+SCF+ACK-2组原始卵泡构成增加,但差别无统计学意义(P>0.05);原始卵泡卵母细胞的直径显著减小(P<0.01),而生长卵泡卵母细胞直径变化不明显(P>0.05);PCNA阳性率显著(P<0.01),E2、P4水平降低,但差别不具有统计学意义(P>0.05)。4.镉对卵巢表达DNMTs的影响:(1)DNMT1:与对照组比较,0.5μM Cd组与10μM Cd组DNMT1 mRNA上调(P<0.05);而10μM Cd组、5-aza-CdR组与10μM Cd+5-aza-CdR组降低(P<0.05);与对照组比较,DNMT1蛋白表达在10μM Cd组升高,其余各组降低,差异具有统计学意义(P<0.01);(2)DNMT3α:与对照组比较,0.5μM Cd组与10μM Cd组DNMT3αmRNA升高(P<0.05);而10μM Cd组、5-aza-CdR组与10μM Cd+5-aza-CdR组降低(P<0.05);与对照组比较,DNMT3α蛋白表达在50μM Cd组降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)DNMT3β:与对照组比较,0.5μM Cd组与10μM Cd组DNMT3βmRNA升高(P<0.05);而50μM Cd组、5-aza-CdR组与10μM Cd+5-aza-CdR组降低(P<0.05);与对照组比较,各处理组DNMT3β蛋白表达无明显差异,不具有统计学意义(P>0.05)。5.镉对卵巢表达SCF/C-KIT基因启动子区DNA甲基化模式的影响:(1)各个剂量组SCF基因启动子区CpG岛呈低甲基化状态,但与对照组比较,各组间的总甲基化率无明显差异(P>0.05);(2)各个剂量组C-KIT基因启动子区CpG岛呈低甲基化状态,但与对照组比较,各组间的总甲基化率无明显差异(P>0.05);结论:1.新生大鼠卵巢镉(5-50μM)暴露后,出现原始卵泡生长发育障碍,雌激素分泌异常。2.新生大鼠卵巢镉(5-50μM)暴露后,SCF/C-KIT mRNA和蛋白表达下调。3.SCF/C-KIT的表达受抑制可能在镉致卵泡发育障碍中起作用。4.新生大鼠卵巢镉(5-50μM)暴露后,卵巢组织DNMTs mRNA和蛋白表达异常,但SCF/C-KIT基因启动子区未出现DNA甲基化模式的改变,尚不能排除与卵泡生长发育相关的其他基因的DNA甲基化模式的变化在镉致卵泡发育毒性中起作用。