目的:手术是治疗膀胱癌的有效方法,能够延长患者的生存期,甚至达到治愈的目的。术后给予化疗是主要的治疗模式,能够降低复发率,延长生存期。尽管采用了手术加化疗的综合治疗,侵袭性膀胱癌仍然有着较高的复发率,并在肿瘤复发过程中增高了病理分级。侵袭性膀胱癌化疗耐药是膀胱癌远期生存率不能有效提高的主要因素。mi RNA定位于二个基因之间或基因的内部,以基因簇、多拷贝或单拷贝的形式存在。miRNA对膀胱癌增殖、EMT、侵袭、迁移及化疗耐药具有重要的调控作用。本研究拟对miR-188-5p及miR-141-3p在膀胱癌组织及细胞中的表达水平进行检测,并观察二者与临床病理参数的相关性,观察二者对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT及顺铂化疗的影响,探讨其通过靶向抑制PTEN激活Akt信号通路发挥调控作用的机制,并通过在体实验进一步验证了miR-188-5p及miR-141-3p靶向抑制PTEN激活Akt通路调控膀胱癌细胞增殖及机制,并观察mi R-188-5p及miR-141-3p在膀胱癌中的协同效应。本研究目的在于评价miR-188-5p及miR-141-3p与膀胱癌的关系,及它们对膀胱癌恶性生物学行为的影响,观察二者是否具有协同效应,并通过离体细胞实验及在体动物实验分析miR-188-5p及miR-141-3p靶向调控PTEN及下游基因的机制,为miR-188-5p及miR-141-3p应用于膀胱癌的早期筛查、诊断、预后判断提供研究基础,并为膀胱癌治疗靶点的选择及联合治疗提供实验依据。研究方法:1.以qRT-PCR检测miR-188-5p和miR-141-3p在膀胱癌组织vs癌旁组织、膀胱癌细胞(5637、T24、BIU87)vs正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)中的差异性表达,分析二者与临床病理参数的相关性,并用生存分析观察患者生存情况,Pearson Rank相关性分析mi R-188-5p和miR-141-3p在组织标本中表达的相关性。2.采用抑制剂(inhibitor)转染5637细胞下调miR-188-5p或miR-141-3p表达,并以miR-188-5p/141-3p inhibitor进行半量联合转染,CCK8实验观察细胞增殖,细胞划痕实验观察细胞迁移,Transwell法观察细胞侵袭。3.以抑制剂(inhibitor)及拟似剂(mimics)转染5637细胞下调或上调miR-188-5p和mi R-141-3p表达,观察TGF-β诱导EMT相关基因(N-cadherin、Fibronectin、E-cadherin、Vimentin)在mRNA和蛋白水平表达的变化。4.以双荧光素酶实验验证miR-188-5p及miR-141-3p与PTEN的靶向关系,并以inhibitor或mimics转染下调或上调miR-188-5p及miR-141-3p表达,进一步验证二者与PTEN的调控关系。5.以mimics转染5637细胞提高miR-188-5p和miR-141-3p的表达,并以miR-188-5p/141-3p mimics进行半量联合转染,同时共转染PTEN质粒(pcDNA3.1-PTEN)上调PTEN,以Transwell法观察上调PTEN是否能逆转mi R-188-5p mimics、miR-141-3p mimics或miR-188-5p/141-3p mimics诱导的迁移及侵袭。6.检测miR-188-5p、miR-141-3p靶向PTEN调控Akt信号通路,以pAkt/Akt比例进行Akt通路活性的判定。7.上调及下调PTEN观察Akt信号通路磷酸化程度,验证Akt是PTEN的下游信号通路。8.采用Akt抑制剂Akt InhibitorⅧ对Akt通路进行阻断,以CCK法检测miR-188-5p及miR-141-3p诱导的5637细胞增殖,并以Western blot检测Ki67表达变化。9.对miR-188-5p mimics、miR-141-3p mimics及miR-188-5p/141-3p mimics稳转5637细胞采用顺铂(CDDP)处理,培养24h观察细胞存活率及凋亡率,评价二者表达上调对5637细胞顺铂化疗的影响。10.通过在体实验验证mi R-188-5p、miR-141-3p及miR-188-5p/141-3p对膀胱肿瘤生长的作用:以miR-188-5p inhibitor、miR-141-3p inhibitor及miR-188-5p/141-3pinhibitor稳转细胞系及对照组(NC)细胞,建立裸鼠皮下成瘤模型,绘制生长曲线,HE染色验证成瘤,评估肿瘤体积、重量差异。11.在裸鼠皮下成瘤模型进一步观察肿瘤组织中PTEN、Akt及pAkt蛋白表达,并以pAkt/Akt比例进行Akt通路活性的判定,检测Ki67表达。结果:1.miR-188-5p和miR-141-3p在膀胱癌组织中表达高于癌旁组织(P<0.0001),miR-188-5p和miR-141-3p在膀胱癌细胞系(5637、T24、BIU87)中表达高于正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)(P<0.05)。2.膀胱癌组织miR-188-5p和miR-141-3p在肿瘤直径≥1cm、淋巴结有转移及远处转移M1患者中表达高于肿瘤直径<1cm、淋巴结无转移、无远处转移M0患者,二者表达水平随着TNM分期增高而增高。3.Pearson Rank相关性分析显示,在膀胱癌组织中mi R-188-5p和miR-141-3p表达在统计学存在正相关(r=0.7651,95%CI:0.606～0.865,P<0.0001)。4.mi R-188-5p及miR-141-3p相对高表达组整体生存率低(P<0.01)。5.下调miR-188-5p或miR-141-3p可以抑制膀胱癌5637细胞增殖、迁移及侵袭,半量联合下调具有协同增效的作用。6.下调miR-188-5p及miR-141-3p表达抑制5637细胞TGF-β诱导的EMT,上调miR-188-5p及miR-141-3p表达促进EMT,miR-188-5p/141-3p半量联合上调和下调均表现协同增效的作用。7.miR-188-5p及miR-141-3p直接靶向作用PTEN的3’-UTR端,二者对PTEN表达具有抑制作用。8.miR-188-5p、miR-141-3p通过抑制PTEN表达诱导5637细胞的侵袭和迁移。9.上调miR-188-5p、miR-141-3p表达后5637细胞Akt磷酸化程度升高,与pcDNA3.1-PTEN共转染后Akt磷酸化程度相对下降,上调PTEN逆转了miR-188-5p、miR-141-3p上调诱导的Akt信号激活。10.Akt是PTEN的下游基因。11.抑制Akt通路减弱mi R-188-5p及miR-141-3p诱导的5637细胞增殖。12.上调miR-188-5p和miR-141-3p表达逆转CDDP对5637细胞增殖的抑制并降低了凋亡率,二者半量协同上调具有增效的作用。13.下调miR-188-5p、miR-141-3p及mi R-188-5p/141-3p对裸鼠膀胱癌皮下成瘤具有抑制作用,肿瘤组织中PTEN蛋白水平升高(P<0.05),pAkt/Akt比例下降(P<0.001),Ki67下降(P<0.05),以上指标在半量联合组均表现更为明显。结论:1.在膀胱癌组织及细胞中,miR-188-5p和miR-141-3p为高表达,miR-188-5p和miR-141-3p的表达与患者总体生存率为负相关,mi R-188-5p和miR-141-3p在组织中的表达与肿瘤直径、淋巴结转移及远处转移的不良临床病理特征正相关。2.下调miR-188-5p或miR-141-3p抑制膀胱癌5637细胞增殖、迁移、侵袭及EMT,二者具有协同效应。3.miR-188-5p及miR-141-3p通过直接靶向抑制PTEN,激活Akt信号通路,促进膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭。4.miR-188-5p、miR-141-3p的表达上调能够逆转顺铂对膀胱癌细胞增殖的抑制,二者具有协同作用。5.下调miR-188-5p和miR-141-3p表达可以抑制裸鼠膀胱癌成瘤,半量联合下调miR-188-5p和miR-141-3p表达的抑制成瘤作用更明显。