急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种常见临床综合征,也是危重症患者常见合并症,若AKI发展至重症急性肾衰竭(acute renal failure,ARF),死亡率可高达50%,并且10%-14%的急性肾衰竭患者因肾功能不能恢复而需要终身肾脏替代治疗。缺血再灌注损伤是引起急性肾衰竭的主要原因之一,常发生于肾移植、心肺旁路手术后、创伤、失血性休克以及脓毒血症等疾病背景下。目前的救治措施除了肾脏替代,尚无其它有效方法。因此阐明缺血性AKI发生机制,探索有效预防和治疗措施对降低AKI发生率和死亡率具有重要科学意义。细胞对缺血缺氧、氧应激以及炎症介质等损害因素的应答本质上是一种应激反应,细胞应激是细胞功能失常甚至死亡的重要原因。内质网是细胞内最大的细胞器,担负极为重要的生理功能,包括转录后修饰、折叠、新合成的分泌蛋白和膜蛋白的组装等,正常的内质网功能是细胞存活并实施生理功能最基本的条件。已证实,细胞一旦因缺氧、低糖以及能量匮乏等因素引起内质网内未折叠蛋白聚集、蛋白超载、细胞内钙稳态失衡,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)机制就会被启动。适宜的ERS通过PERK(PKR-like ER kinase)/ eIf2(eukaryotic translation initiation factor 2)、IRE1α(inositol requiring kinase 1)/ XBP1(X-box binding protein-1)和ATF6(mRNA encoding transcription factors )信号途径,减缓基因转录抑制新蛋白合成;上调内质网伴侣蛋白如糖调节蛋白-78(Glucose-regulated protein 78,GRP-78)和热休克蛋白-70等分子的表达以帮助蛋白正确折叠、修饰和转运,进而维持内质网内稳态使细胞免受各种应激的损害作用。当ERS过强或持续时间过长,内质网稳态不能重新建立,则通过激活下游损害效应途径包括ATF4/CHOP(又称生长停滞及DNA损伤基因153,growth arrest and DNA damage inducible gene 153,GADD153)、ATF6/CHOP、Caspase-12和Ask1/JNK通路引起细胞凋亡。此外,过度ERS还可以激活NF-κB和炎性caspase(infalmmatary caspase)信号途径引起非感染性炎症反应。已证实,过度内质网应激是急性缺血性心脏和脑组织损伤的重要机制。在肾脏,缺血再灌注通过上调ATF4/CHOP途径引起肾小管上皮细胞凋亡。目前认为,ERS是细胞对有害刺激的应答机制中最为关键的环节,调控保护性内质网伴侣分子和过度内质网应激的效应分子表达,是增强组织损伤耐受性的重要途径。已有研究发现,低剂量内质网诱导剂预处理可通过上调肾组织内质网伴侣分子如糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78),热休克蛋白等伴侣分子表达,显著减轻肾组织缺血再灌注损伤,说明内质网应激预处理可以上调内质网伴侣分子发挥肾保护作用。那么内质网预处理是否还可通过抑制过度内质网应激途径保护肾组织免受缺血再灌注损伤?肾小管上皮细胞凋亡和炎症反应是急性缺血性肾损伤的重要病理生理基础。已证实,急性缺血再灌注启动过度内质网应激是肾小管上皮细胞凋亡的重要机制,但内质网应激在急性缺血性肾损伤炎症反应中的作用和机制目前尚不十分清楚。IL-1β是炎症反应早期产生的促炎细胞因子,具有放大炎症反应瀑布的重要生物学作用,在急性缺血性肾损伤的发生发展中扮演了重要角色。研究发现,在内毒素肺损伤、急性胰腺炎以及结肠炎等疾病状态下,过度内质网应激通过上调CHOP表达激活炎症caspase途径,活化IL-1β转化酶(caspase-1),进而促进IL-1β前体活化为成熟IL-1β。我们前期研究发现,急性缺血再灌注可上调肾组织CHOP表达和IL-1β水平,而抑制CHOP表达可以减少IL-1β产生,说明CHOP表达增加可能是急性缺血性肾损伤炎症反应的重要机制。本课题进一步研究急性缺血再灌注后肾组织CHOP、炎性caspase表达以及IL-1β变化的规律,并观察衣霉素预处理对CHOP以及肾组织炎症反应的影响,为内质网应激预处理防治急性缺血性肾损伤提供科学依据。一、实验方法1、急性缺血再灌注对肾组织CHOP及其下游效应分子表达的影响采用双肾蒂夹闭缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤模型。用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂40min后放开双侧动脉夹再灌注,以保温毯保持体温。分别在1、6、12、24 h后取标本检测血Cr、BUN水平。PAS染色检测肾组织病理改变,分别以免疫组化和Western blot方法检测肾组织GRP78、CHOP、caspase 11、caspase 1、IL-1β蛋白质表达。2、内质网应激预处理提高肾组织对缺血再灌注损伤耐受性的作用及机制采用双肾蒂夹闭缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤模型,双侧肾蒂40min后放开双侧动脉夹再灌注12h。大鼠随机分为5组:对照组,I/R12h组,TM组,TM+I/R12h组,DMSO+I/R12h组。对照组只开腹,不夹闭肾蒂。TM预处理组于手术前24h腹腔内给药(0.6mg/kg)。DMSO+I/R12h组于手术前24h给予等剂量DMSO(1ml 2%DMSO,不含TM)。取标本后检测血Cr、BUN水平。肾组织PAS染色评估肾组织损伤,Western blot方法检测肾组织GRP78、CHOP、Caspase 11、Caspase 1、IL-1β蛋白质表达。免疫组化检测肾组织GRP78、CHOP表达。二、结果1、急性缺血再灌注后肾组织CHOP、炎性caspase表达以及IL-β的变化规律1.1肾功能变化及肾组织病理改变肾功能变化:与对照组比较,血清肌酐I/R1h时无明显变化,I/R6h开始升高,12h达到峰值,24h下降。病理变化: I/R 1 h,皮髓交界处肾小管上皮细胞浊肿,空泡样变,偶见肾小管上皮细胞脱落;I/R 6h,可见部分肾小管上皮细胞脱落、形成细胞管型;I/R 12h病变最为严重,肾小管上皮细胞广泛坏死脱落形成大量细胞管型,基底膜裸露,部分肾小管扩张,肾间质水肿和单个核细胞浸润;I/R24h肾小管管腔中仍可坏死脱落的上皮细胞,但管型减少,肾间质水肿减轻。1.2急性缺血再灌注对肾组织CHOP、炎性caspase表达以及IL-β影响GRP78表达变化:I/R后1h开始升高,12h达到峰值,24h开始下降,但仍高于对照组水平。CHOP表达变化:对照组CHOP有基础水平表达,I/R1h时开始增加,I/R6h时显著增多,I/R12h达峰值,I/R24h开始下降。Caspase-11表达变化:对照组caspase-11前体有基础水平表达,I/R1h时无明显增加,I/R6h时显著增多,I/R12h达峰值,I/R24h开始减少;活性caspase-11在I/R6h时开始增加,I/R12h达峰值,I/R24h开始减少。Caspase-1表达变化:对照组caspase-1前体有基础水平表达,I/R1h时表达开始增加,I/R6h时显著增多,I/R24h开始减少;活性caspase-1在I/R1h时开始增加,I/R12h达峰值,I/R24h开始减少。IL-1β表达变化:对照组IL-1β前体有基础水平表达,I/R1h时与对照组比较无明显增加,I/R6h时显著增多,I/R24h开始减少;成熟IL-1β在I/R1h时即开始增加,I/R12h达峰值,I/R24h开始减少。2、内质网应激预处理提高肾组织对缺血再灌注损伤耐受性的作用及机制2.1衣霉素预处理对缺血再灌注大鼠肾损伤的保护作用低剂量衣霉素组血清肌酐水平与对照组比较无显著差异,光镜下也未见明显肾组织病理改变,说明低剂量衣霉素对肾组织结构和功能无明显影响。衣霉素预处理组血清肌酐水平显著低于I/R12h组,肾组织病理改变显著减轻,说明衣霉素预处理可显著提高肾组织对缺血再灌注损伤的耐受性。2.2衣霉素预处理对缺血再灌注肾组织CHOP、炎性caspase以及IL-β的影响GRP78表达变化:与对照组比较,低剂量衣霉素可诱导肾组织GRP78表达,I/R12h后肾组织GRP78表达增加更为显著,衣霉素预处理组的缺血再灌注肾组织GRP78表达增加显著高于I/R12h组。CHOP表达变化:与对照组比较,低剂量衣霉素对肾组织CHOP表达无明显影响;I/R12h后肾组织CHOP表达显著增加;衣霉素预处理可使缺血再灌注肾组织CHOP表达显著减少。Caspase -11、1、IL-1β表达变化:与对照组比较,低剂量衣霉素对Caspase -11、1、IL-1β表达和活化均无明显影响;I/R12h后肾组织Caspase -11、1、IL-1β表达和活化显著增加;衣霉素预处理可以显著抑制缺血再灌注肾组织Caspase -11、1、IL-1β表达和活化。三、结论1、急性缺血再灌注可引起肾组织过度内质网应激,CHOP表达上调。CHOP表达增加先于caspase-11和caspase-1表达变化,caspase-1的活化与成熟IL-1β水平的变化一致,提示缺血再灌注可启动过度ERS,CHOP可能通过调控炎性caspase途径促进肾组织IL-1β的产生,这可能是急性缺血性肾损伤炎症反应的重要机制。2、内质网应激预处理能显著上调I/R后肾组织GRP78表达,抑制CHOP表达,活性caspase-11、caspase-1以及成熟IL-1β水平显著降低,肾组织损伤显著减轻,提示内质网应激预处理对缺血再灌注肾损伤具有保护作用,其效应机制可能涉及上调内质网伴侣分子以及抑制内质网过度应激相关的炎症反应。