本研究以对乙型肝炎有确切疗效的丁香叶中的有效成分丁香苦苷和羟基酪醉为模型药物,制备同时包载两种中药成分的mPEG-PLG A纳米粒,构建长效和靶向融为一体的纳米递药系统。探讨以mPEG-PLGA嵌段共聚物为载体的中药多成分纳米递药系统包封和释放规律,通过体内、体外研究以期达到肝细胞内递药目的。1. S H双载药纳米粒的工艺与处方优化以纳米粒的粒径、包封率、载药量等为评价指标,采用单因素考察法与星点设计-效应面法相结合进行工艺与处方优化。优化结果表明,以mPEG-PLGA嵌段共聚物为载体材料,F68为稳定剂,采用沉淀法制备的SH双载药纳米粒溶液外观呈现淡蓝色乳光,总包封率及总载药量分别为(32.3 8±1.21 ) %和(12.01±0.32) %。采用比较实验法进行冻干工艺研究,结果显示,浓度为5%的甘露醇作为冻干保护剂的SH-NPs冻干粉外观呈疏松的白色粉末,复溶性良好。三批验证产品显示,重现性较好,工艺可行。2.SH双载药纳米粒特性研究采用透射电镜观察S H双载药纳米粒的形态,Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析仪测定纳米粒粒径、PDI及Zeta电位。结果显示,SH双载药纳米粒形态圆整,分布均匀,粒径及PDI值分别为91.70±2.1 1 nm和0.22±0.01 , Zeta电位为-24.9±1.16mV。采用动态透析法,以pH7.4的PBS为释药介质,3 7℃恒温避光恒速(100rpm)搅拌下进行SH双载药纳米粒的体外释药实验。结果显示,SH双载药纳米粒体外释药曲线符合Higuchi方程,拟合系数R2分别为0.97 9和0.9 84,证明,S H双载药纳米粒有一定的缓释作用。数据表明,分子量小、体积小的HT包封率和释放速率大于SYR。3.SH双载药纳米粒药动学研究以SH生理盐水溶液为对照组,研究SH双载药纳米粒的药动学参数,在设计的时间点大鼠眼眶取血,UPLC法测定S YR和HT的血药浓度,用DAS2.0软件进行处理数据,拟合药动学参数。结果表明,对照组与纳米粒组的药时过程均符合二室模型动力学特征。在给药剂量相同时,纳米粒组与对照组相比,纳米粒组中SYR和HT的消除半衰期T1/2β分别是对照组的3.17倍和2.32倍,AUC分别是对照组的3.70倍与5.55倍。T1/2β显著延长,AUC明显增高,说明将SYR和HT制成纳米粒后,延长了药物在体内的循环时间,提高了药物生物利用度,具有一定的长循环效果。4.SH双载药纳米粒靶向性研究以昆明小鼠为实验动物进行靶向性研究。小鼠尾静脉注射SH双载药纳米粒溶液和SH生理盐水溶液,UPLC法检测全血及各组织中S YR和HT的浓度,以药物的相对靶向率(RT E)和相对摄取率(R U E)评价载药纳米粒给药后小鼠体内分布情况。实验表明,与S H生理盐水组比较, S H双载药纳米粒组能显著增加给药后小鼠肝组织内SYR和HT的药物含量,从药物的RTE和RUE来看,SH双载药纳米粒能明显提高SYR和HT在肝脏中的分布,显示S H双载药纳米粒具备一定的肝靶向特性。小鼠尾静脉注射FITC标记的SH双载药纳米粒溶液和FITC溶液,采用荧光内窥式激光共聚焦成像系统,对小鼠活体内实时细胞尺寸水平观测,探讨纳米粒能否进入肝细胞内。结果表明,FITC溶液组没有荧光,排除FITC的干扰。对于FITC标记的SH-NPs组,随着时间的延长,纳米粒由细胞外逐渐进入到细胞内部,数量亦逐渐增加,具有正相关性。因此,SH双载药纳米粒是可以靶向肝细胞内的。5. SH双载药纳米粒细胞毒性研究采用MTT法考察SH双载药纳米粒对HepG2.2.1 5细胞的毒性,采用流式细胞仪进行细胞周期的研究。结果表明,游离药物组与SH-NPs对HepG2.2.15细胞增殖均具有抑制作用,并随药物浓度的增加抑制率增大;相同浓度时,各组药物的抑制率随时间延长而上升;SH-NPs组随孵育时间延长,抑制率逐渐升高并达到游离药物的抑制水平,表明SH-NPs组有明显的缓释效应。随药物浓度的增加,G 1和G2期无明显变化,S期的DNA含量明显增高,提示SH-NPs能阻滞细胞周期于S期。6. SH双载药纳米粒细胞摄取的研究(1)细胞摄取研究采用荧光显微镜对HepG2.2.1 5细胞摄取定性分析,流式细胞仪对HepG2.2.15细胞摄取定量分析。荧光显微镜考察结果显示,未用FITC标记的空白NPs和FITC溶液共孵育的细胞没有荧光,排除了载体和游离FITC的干扰。FITC-SH-NPs与细胞作用后可以观察到荧光,亮点密度和荧光强度随着NPs浓度的增加而逐渐增加。流式细胞仪测定结果显示,各实验组与HepG2.2.15细胞孵育后,空白NPs组、FITC溶液组没有荧光,排除了空白NPs和FITC分子对实验结果的影响。随着药物浓度的增大、孵育时间的延长,荧光强度增大,表明细胞摄取量与药物浓度、孵育时间成正相关;37℃时细胞对FITC-SH-NPs的摄取量明显高于4℃时,说明细胞摄取存在主动转运的过程。(2)内吞抑制剂对细胞摄取取抑制作用的研究利用流式细胞仪进行秋水仙索与氯喹对细胞摄取的研究。结果表明,秋水仙素与氯喹对细胞摄取均具有抑制作用,随着与HepG2.2.15细胞孵育时间的延长,两种抑制剂对细胞摄取的抑制作用减弱,且氯喹对细胞摄取抑制作用弱于秋水仙素。随着FITC-SH-NPs浓度增加,阳性细胞百分率增加不明显,表明FITC-SH-NPs浓度对两种抑制剂对细胞摄取的抑制作用影响较小。7.SH双载药纳米粒药效学研究建立D-GalN诱导的大鼠急性肝损伤模型,采用半自动生化分析仪分析血清中ALT、AST活性,紫外可见分光光度计测定肝匀浆中SOD活性和MDA含量,光学显微镜观察HE染色病理切片,探讨SH双载药纳米粒的保肝作用。结果表明,各药物组均能降低大鼠血清中ALT、AST活性,提高其肝匀浆SOD活性,降低肝匀浆MDA含量,亦能降低肝脏系数,能明显改善肝组织损伤的程度。SH-NPs组与SH组能明显减轻肝组织变性和坏死程度,并减轻炎症反应,且SH-NPs作用更为明显,说明,SH双载药纳米粒对D-GalN诱导的大鼠急性肝损伤有明显的预防保护作用。ELISA法检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg表达水平。结果表明,阳性对照药组和SH-NPs组均可抑制HepG2.2.1 5细胞上清液中HBsAg与HBeAg的分泌,与空白对照组比较有显著差异(P < 0.05,P <0.01)。SH-NPs组在作用144 h,质量浓度为3.2μg/mL时,对HBsAg的抑制率最高,达44.6%,抑制作用强于阳性对照药。SH-NPs对HBsAg、HBeAg的抑制作用呈现较明显的量效关系和时效关系。SH双载药纳米粒具有一定的抗乙肝病毒作用。综上,本文成功制备SH双载药纳米粒,并构建了适合于水溶性药物的高包封率、高载药量的多成分纳米递药系统。初步探索了以mPEG-PLGA为纳米载体制备水溶性多成分纳米粒中药物的包封及释药规律,数据表明,分子量小、体积小的HTL比分子量大、体积大的SYRSYR包封率高,释药速率的快。SH双载药纳米粒有长循环性和肝靶向性,可实现细胞内靶向,对D-半乳糖胺诱导的急性小鼠肝损伤有保护作用,对HepG2. 2. 15细胞增殖、HBsAg、HBeAg有抑制作用。本文为水溶性的中药多成分纳米递药系统的研究提供了方法和技术。