为了获取木质纤维素多糖降解酶基因,本文以Fosmid为载体构建了约含9500个克隆的山羊瘤胃微生物宏基因组文库。该文库的阳性率为100%,插入片段均值大于30kb,包含了至少285Mb的宏基因组信息。通过刚果红染色法筛选获得了EcoRl酶切图谱不同的6个葡聚糖酶阳性克隆和4个木聚糖酶阳性克隆。初步分析了阳性克隆的末端序列、酶谱和粗酶的酶学性质,发现葡聚糖酶阳性克隆10的GRFosCEL-10末端序列与已知序列的一致度最低(identity57%),推测其插入序列新颖性较高,葡聚糖酶阳性克隆2、3、9、13的粗酶在pH4.0时呈现出最高活性,推测其中可能含有耐酸性葡聚糖酶。4个木聚糖酶阳性克隆Fosmid的末端序列与已知序列相似度均较低(identity26-51%),说明其插入序列的新颖性较高,另外,4个克隆粗酶的最适pH和温度一致,均为7.0和50℃。选取葡聚糖酶阳性克隆10的GRFosCEL-10进行全序列测定,从中分析得到了4个糖苷水解酶编码基因,orf11、12、16和18。BlastP比对分析4个基因的氨基酸序列发现ORF11(命名为CelA)与源于Roseburia intestinalis L1-82的内切葡聚糖酶具有最高相似性,一致度为55%；ORF12与Prevotella ruminicola23来源的GHF43糖苷水解酶具有最高相似性,一致度为36%；ORF16与Ruminococcaceae bacterium来源的p-葡糖苷酶具有最高相似性,一致度为39%；ORF18与Bryantella formatexigens DSM14469来源的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶具有最高相似性,一致度为64%。选取celA基因进行后续分析,该基因长1,449bp,预测编码蛋白大小为53.2kDa。其编码蛋白由N端～90个氨基酸大小的未知功能序列和C端的糖苷水解酶第5家族催化结构域组成。序列比对发现其催化结构域活性中心为Glu280和Glu412。37℃异源表达4h后得到了截短表达的大小为45kDa的蛋白,N端测序结果表明该截短蛋白起始于全长蛋白的第112个氨基酸。将CelA的截短蛋白进行了纯化及后续的功能分析,发现其最适pH为7.0,最适温度为50。C,在pH4.0-10.0中放置24h可保留大于60%的活性,具有较广的pH耐受性。并且,金属离子中10mM Mg2+、Ca2+和Mn2+可显著促进酶活性至211%、228%和264%,1mM Cr3+和化学试剂EDTA同样具有较明显的促进作用。该酶具有很强的盐离子耐受性,0-3.5M NaCl和KCl均对该酶活性起到促进作用,并且1M NaCl和KCl可分别将其活性提高至3倍和2倍。另外,CelA具有较广的底物降解能力,可以降解多种p-1,4键连接的底物,并对p-1,3/4键连接的地衣多糖和大麦葡聚糖显现出最高活性。综上而言,CelA的活性可被几种常见的金属离子和化学试剂显著促进,并且其具有很强的盐离子耐受性和较广的底物降解能力,表明其具有潜在的工业应用价值。选取木聚糖酶阳性克隆10中GRFosXYL-10进行全序列测定,分析得到了一条木聚糖酶基因xyn10A。序列比对发现在已知功能的蛋白中,其与来源于Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85的family10glycosyl hydrolase XynB (accession number:AAG36763)具有最高相似性,一致度达47%。该基因全长2709bp,编码902个氨基酸,理论分子量为98.6kDa,理论等电点为5.36。结构域分析表明其包含一个N端的GHF10催化结构域和C端两个连续的CBM6碳水化合物结合结构域,分别命名为CBM6-1和CBM6-2,两者的一致度为53%。该模块结构在糖苷水解酶第10家族木聚糖酶中属于一种新型的模块结构。为了研究Xyn10A的功能,我们异源表达并纯化了截掉信号肽的Xyn10A-TX1以及进而截掉C端两个CBM6结构域的Xyn10A-TX2,并进行了后续的性质分析。Xyn10A-TX1的最适pH为7.0,最适温度为45℃,其不耐受高温,但对碱性环境具有一定耐受性。多数金属离子对其显示抑制作用,但1mM的重金属离子Pb2+、C02+、Cr3+对酶活性有较明显促进作用。化学试剂EDTA、Tween20、DTT同样对酶活性具有显著促进。另外,Xyn10A-TX1对不可溶燕麦木聚糖具有较高降解活性和结合能力,且可以结合不可溶底物Avicel。截掉两个CBM6后,Xyn10A-TX2的最适pH变为6.5,最适温度提高了10℃,并对不可溶燕麦木聚糖的结合能力和降解能力均有较明显降低,说明CBM6-1和CBM6-2在Xyn10A对不可溶底物的结合和降解上发挥着重要作用。