近年来，双光子荧光共聚焦显微成像技术（TPM），作为一种新型的光学成像技术逐渐引起人们的极大关注与传统单光子激发荧光显微成像（OPM）相比，双光子激发（TPE）以近红外光子作为激发光源，具有组织自发荧光和自吸收低光损伤和光漂白弱空间分别率高和组织穿透深(>500m)等优点双光子（TP）探针的构建是TPE技术发展的关键到目前为止，尽管已有很多具有优良双光子吸收（TPA）特性的探针被报道和应用于生物医学成像领域，但是大部分集中在有机小分子方面，这样TPE有机探针就不可避免地存在细胞膜穿透性差抗光漂白性能低和细胞定位能力差等有机小分子的固有缺陷此外，对于生物分子检测，基于TPA有机分子探针的设计和合成仍然存在巨大挑战随着纳米技术的发展和纳米结构所具有的优良性质，如抗酶切性能载体性质循环时间可调控性高通透性和滞留（EPR）增强效应等，TPA纳米探针将为TPE成像方法的广泛应用提供一种重要的研究基础与此同时，环糊精聚合物（CDP）是以物理混配法或化学键组成的含有多个环糊精（CD）单元的高分子聚合物CDP也是近年来发展的一种生物相容性较好无生物毒性的新型载体它既保留环糊精自身的催化包结缓释和识别的能力，又在聚合过程中形成多个支点构成的空间三维网络结构，兼具了聚合物的化学可调性和良好的机械强度等优点结合甲基丙烯酸甲酯甲基丙烯酸共聚物（PMMA-co-MAA）金纳米颗粒（AuNPs）和CDP等纳米材料所具有的独特性能，以及TPM技术优良的组织穿透性能和较高的空间分辨率本论文选择具有双光子性质的有机小分子为研究对象，构建了一系列新型高生物适应性的双光子荧光纳米探针，并将其应用在与生命活动密切相关的离子蛋白酶的定量检测及生物医学靶向成像等领域，具体开展以下几个工作：（一）构建了一种以反式-4-[对-(N,N-二乙基胺基)苯基]乙烯基-4‘-（4-N,N-二乙胺基）苯(DEAS)为双光子染料，通过共沉淀-自组装法形成的新型DEAS@PMMA-co-MAA双光子荧光纳米探针PMMA-co-MAA对染料DEAS的包裹，改善了双光子有机小分子的水溶性生物相容性以及双光子性质同时将该体系成功应用于活细胞及深层组织中的双光子成像研究（二）构建了一种以双光子有机分子（TPdye）为生物标记的荧光团AuNPs为纳米载体的新型AuNPs@CDGRG-TPdye荧光纳米探针，通过多肽序列定点切割及AuNPs溶解等设计机理，实现对深层组织中胶原蛋白酶collagenase的活性成像应用及复杂体系中CN-的定量检测（三）发展了一种基于双光子有机分子反式-4-[对-(N,N-二乙基胺基)苯基]乙烯基-N-甲基吡啶碘(DEASPI)与CD之间的主客体相互作用的TPA DEASPI/CDP纳米胶束的构建新策略该TPA超分子纳米胶束表现出优良的双光子荧光性质较高的光学稳定性良好的细胞膜穿透性和优良的生物相容性等特点并且进一步将靶向多肽RGD交联在纳米胶束表面，成功实现在癌细胞和深层肿瘤组织中的靶向双光子成像研究应用该设计策略为未来开发各种独特传感方法并应用于癌症诊断和生物成像研究等领域开辟了新的途径（四）在上一章基础上，本章发展了一种基于TPA纳米胶束的双光子荧光纳米探针，用于活细胞和组织中高灵敏度和高选择性的细胞凋亡蛋白酶caspase-3的活性检测及成像应用基于DEASPI/βCDP纳米胶束的TPA荧光纳米交联物提供了一种高灵敏度和高选择性的探针，用于复杂生物条件下caspase-3的定量检测该纳米交联物也可以被有效地运输到活细胞中，作为一种信号增强型荧光探针用于靶生物分子的高特异性和高分辨率成像研究