肝癌的发病率呈逐年上升趋势，目前肝细胞癌己成为我国第二大恶性肿瘤，每年死于肝癌的病人位列全球第一[1]。逐年增高的发病率和停滞不前的预后结果为临床治疗肝细胞癌带来越来越严峻的挑战。目前肝细胞癌的治疗尚无切实有效的手段，手术是唯一有望可以使其获得根治的方式，但实际上在临床适合于根治性治疗的患者不足一半，因此，化疗成为晚期肝癌及术后复发肝癌的重要治疗手段。但多药耐药的产生大大的影响了化疗药物的疗效，而且发现即使是开始对化疗敏感的肝癌细胞，在化疗后也常常出现耐药现象，最终导致化疗失败。多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤在接触一种化疗药物后，不仅对这种药物产生耐药，而且对其他结构及作用机制不同的化疗药物产生了交叉耐受的现象。MDR的主要特征包括:①对自然界的许多亲脂性的细胞毒药物和抗肿瘤药物耐药;②能够通过ATP-依赖泵将细胞内药物泵出进而降低其有效浓度;③主要通过多药耐药基因及其编码蛋白的过度表达而引发耐药。目前认为mdrl过表达是产生MDR的主要机制[2，3]。学者研究发现[4,5]，将包含人mdrl全长cDNA的重组载体转染入细胞后，重组mdrlcDNA可以产生有功能的P-gp蛋白，这些基因或者蛋白的高表达致使细胞形成MDR表型。因此，抑制mdr1mRNA及其编码P-gp蛋白的表达是研究逆转MDR的重点。MDR是肿瘤化疗过程中亟待解决的难题。近年来筛选具有抗癌作用的天然药物已成为研究的热点。苦参碱类生物碱是存在于豆科植物苦参、苦豆子等草药中的有效成份。并且在包括宫颈癌、卵巢癌、胃癌、白血病、结肠癌、肝癌、恶性胶质瘤等多种肿瘤细胞中均发现苦参碱具有抗肿瘤作用，苦参碱能在体内、外对多种肿瘤细胞起作用，诱导肿瘤细胞凋亡且无明显的毒、副反应。然而，苦参碱抗肿瘤作用及其诱导凋亡的机制还不明确。目前，对祖国传统中草药进行大力开发，采用分子生物学等手段研究其药理学作用，致力于新抗癌药物的开发，已成为当前中药研究的发展趋势。在这样的背景下，深入探讨苦参碱对肿瘤的影响和作用的分子机制，无疑是一项前景广泛而且很有研究价值的课题。本实验以大鼠肝癌细胞株CRBH-7919细胞及其MDR细胞株CRBH-7919/mdr1为研究对象，通过体外实验研究苦参碱对大鼠肝癌及其耐药细胞增殖和耐药性的影响，明确苦参碱是否能在体外诱导大鼠肝癌细胞株CRBH-7919细胞及其MDR细胞株CRBH-7919/mdr1凋亡;研究苦参碱诱导CRBH-7919及CRBH-7919/mdr1细胞凋亡的分子作用机制;明确苦参碱是否对凋亡调控分子p53、Fas及Bcl-2蛋白表达水平产生影响；研究旨在证实苦参碱的抗肿瘤活性，并进一步寻找其可能的潜在作用靶点与机制。1.构建多药耐药基因(mdrl)过表达细胞模型迄今为止，通过体外诱导建立MDR细胞株，仍然是研究导致肿瘤产生耐药性的分子生物学基础。本研究采用基因克隆技术，将mdrl cDNA与真核表达载体PCI-neo相连，并导入大鼠肝癌细胞株CRBH-7919细胞，G418筛选出稳定的MDR细胞株CRBH-7919/mdr1细胞。并采用实时定量PCR和免疫印迹法检测CRBH-7919/mdr1细胞mdrl基因及其编码蛋白P-gp的表达较CRBH-7919细胞高，确定模型构建成功。2.苦参碱对大鼠肝癌细胞株CRBH-7919及其耐药细胞CRBH-7919/mdr1生长抑制及耐药性的影响用不同药物浓度苦参碱处理CRBH-7919及CRBH-7919/mdr1细胞后，用MTT法测细胞的增殖抑制情况，结果显示不同浓度苦参碱作用48h后，两种细胞的增殖均不同程度地受到抑制，且这种现象呈浓度和时间依赖性；实时定量PCR和蛋白免疫印迹结果显示：经过浓度分别为0、0.25、0.50、1.00mg/ml的苦参碱作用CRBH-7919/mdr1细胞24h和48h后，与未加药的对照组细胞相比P-gp mRNA与蛋白表达量与苦参碱浓度呈剂量依赖性下降。提示苦参碱不仅可以抑制CRBH-7919及CRBH-7919/mdr1细胞的增殖，而且可以一定程度上逆转MDR细胞的耐药性。3.苦参碱对大鼠肝癌细胞株CRBH-7919及其耐药细胞CRBH-7919/mdr1诱导凋亡的研究凋亡(apoptosis)的检测方法颇多,常用的有电镜、DNA凝胶电泳、流式细胞仪PI染色、TUNEL原位末端标记等。本研究中通过光镜下细胞形态学观察、DNA凝胶电泳及流式细胞仪DNA含量分析等均可证实苦参碱不仅可诱导药物敏感细胞CRBH-7919凋亡,同样对其多药耐药细胞株亦有明显的诱导凋亡作用。提示苦参碱可通过诱导细胞凋亡而达到杀伤肿瘤细胞的作用,并可克服肿瘤细胞的MDR现象。故苦参碱有可能成为1种理想的天然抗肿瘤制剂,尤其对治疗后复发或转移的化疗耐药患者治疗或许可获得一定的疗效。本研究中流式细胞仪分析结果显示,苦参碱作用后有一定程度的S期细胞比例增高,相应的G2/M比例下降,提示苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡可能与其S期阻滞有关。设想若能先使用苦参碱使肿瘤细胞阻滞于S期,再联合使用S期特异性药物,应可提高化疗药物的敏感性。因苦参碱作用24h和48h后的凋亡细胞比例并无显著差异,提示凋亡在24h内即可发生。细胞凋亡的启动又是1个复杂的涉及多基因的过程,如野生型p53、c-myc、Fas、bcl-2/Bax等都参与了对凋亡的调控。我们的实验发现用不同药物浓度苦参碱处理CRBH-7919及CRBH-7919/mdr1细胞不同时间后，促凋亡基因P53及Fas基因的mRAN和蛋白表达水平增加，而抑制凋亡的Bcl-2mRAN和蛋白表则降低。且这两种现象均与作用的苦参碱呈浓度与时间依赖性。苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡过程中是否有调控基因的激活和转录,有无MDR相关基因的表达改变等,我们将作进一步的研究。