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马腺疫是由马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi,S.equi)引起的马属动物急性发热接触性的传染病。该病主要以头部和颈部淋巴结肿胀为主要特征,对幼驹危害较大,威胁着我国养马业的发展。三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是该病原菌的重要毒力因子且在该菌研究较少,为探究其在该菌致病及免疫中作用,本研究对马链球菌马亚种的GAPDH蛋白进行重组表达,以小鼠为模型进行了免疫生物学特性的研究。本研究扩增了GAPDH基因大小不同的2个片段,构建原核表达质粒p ET-28a-GAPDH-L和p ET-28a-GAPDH-S。经诱导后,SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的大小分别为30 k Da和45k Da,Western blot表明重组蛋白具有较好免疫原性,将纯化后的GAPDH-L、GAPDH-S、EAG、Se M蛋白分别及联合免疫小鼠后,经ELISA检测免疫后小鼠抗体水平及亚型,结果表明,重组蛋白免疫小鼠后均能产生较高水平的抗体,GAPDH-S免疫小鼠后产生的抗体效价(1:24300)高于GAPDH-L抗体效价(1:8100),EAG+Se M+GAPDH-S免疫组抗体效价最高(1:218700),高于EAG+GAPDH-S、Se M+GAPDH-S免疫组的抗体效价(1:72900)和GAPDH-S、EAG和Se M免疫组抗体效价(1:24300)。抗体分型检测结果显示产生的抗体亚型主要以Ig G1和Ig G2b为主。选取马链球菌马亚种ZZM-3对各免疫组小鼠进行攻击,检测存活率、心肝脾肺肾的荷菌量和病理组织学变化。结果表明,GAPDH-S免疫组的攻击存活率为87.5%,高于GAPDH-L存活率75%;EAG+Se M+GAPDH-S免疫组攻击存活率为100%,高于EAG+GAPDH-S、GAPDH-S免疫组攻击存活率87.5%和Se M、EAG、Se M+GAPDH-S免疫组的攻击存活率75%。荷菌量检测结果表明GAPDH-S免疫组心、脾和肺中的荷菌量显著低于GAPDH-L,GAPDH-L免疫组可明显降低肝脏荷菌量(P<0.05)。EAG+Se M+GAPDH-S免疫组脏器荷菌量显著低于其他单独和联合免疫组(P<0.05)。病理组织学观察结果表明,GAPDH-S免疫组对肝、脾和肺的保护效果优于GAPDH-L免疫组;各免疫组对肾脏均有保护效果,EAG+Se M+GAPDH-S对肝脏、脾脏保护效果好,GAPDH-S和EAG+Se M+GAPDH-S对肺保护效果好。为比较GAPDH-S与Se M蛋白的免疫保护效果,选取不同种的病原菌检测攻击存活率,结果表明Se M蛋白仅对马链球菌马亚种有75%的攻击存活率,而GAPDH-S蛋白对不同病原菌的攻击存活率在50%～87.5%,表明该蛋白具有较广泛的保护效果。利用流式细胞分析GAPDH-L、GAPDH-S免疫小鼠脾淋巴细胞,荧光定量PCR分析GAPDH-L、GAPDH-S、EAG、Se M免疫后免疫相关因子表达情况。流式细胞检测结果表明GAPDH-S免疫小鼠后诱导产生CD4~+、CD8~+、CD69~+水平显著高于GAPDH-L免疫组(P<0.05);real-time PCR检测结果显示,各免疫组均可以促进细胞因子IL-10、TLR2、TLR3、TLR4、TCR、MHC-Ι和RP105的表达水平升高。GAPDH-L免疫组IL-10表达量显著高于GAPDH-S免疫组(P<0.05),EAG免疫组诱导产生的IL-10含量显著高于联合免疫组(P<0.05);GAPDH-S免疫组TLR2、TLR3、TLR4、TCR、MHC-Ι和RP105的表达水平显著高于GAPDH-L免疫组(P<0.05);EAG+Se M+GAPDH免疫组诱导产生MHC-Ι、RP105、TCR、TLR3显著高于其他免疫组;GAPDH-S诱导产生的TLR2和TLR4水平显著高于其他免疫组。S.equi GAPDH蛋白单独或联合其他蛋白免疫均对小鼠产生了良好的免疫效果且对S.equi的攻击具有较高的保护率,本研究的结果为今后开展马腺疫防控的研究提供一定的实验依据。