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肿瘤已经成为威胁人类健康最主要因素之一。全球每年罹患恶性肿瘤死亡人数高达数百万人,根据世界卫生组织2014年2月发布的全球癌症报告显示,仅2012年全球共新增1400万癌症病例并有820万人死亡,其中,中国新增307万癌症患者死亡220万人。目前,治疗肿瘤的传统方法主要有手术、放疗、化疗和中医治疗等,但这些方法可能存在治疗创伤大、治疗效果不甚理想等问题。近年来,细胞免疫治疗逐渐成为治疗肿瘤的新方法,通过体外刺激自体免疫细胞并回输体内达到杀伤肿瘤细胞的目的,这些活化的免疫细胞能够特异性针对肿瘤细胞发挥治疗作用。淋巴因子激活杀伤细胞(Lymphokine Activated Killerer Cell,LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltration Lymphocyte,TIL)和细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer,CIK)可应用于肿瘤的细胞免疫治疗,但这些细胞仍然存在难以持久杀伤肿瘤细胞的问题.此外,肿瘤患者体内环境通常处于免疫抑制状态,自体免疫细胞需要经过体外活化后才能具有抗肿瘤作用。因此,人们不断寻求更多能够发挥抗肿瘤作用的免疫细胞。现有研究表明,同种异体干细胞移植可以治愈多发性骨髓瘤,治疗急慢性淋巴细胞白血病;同种异体移植可以用于降低骨巨细胞瘤手术后复发率;同种异体移植能够诱导受体产生记忆性T细胞。采取免疫抑制措施会诱发接受器官移植的患者产生某些恶性肿瘤,如非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)。这些结果提示同种异体移植也许可以诱导记忆性T细胞产生抗肿瘤作用。记忆性T细胞(Memory T cell)是T细胞亚群之一。幼稚T细胞经初次免疫反应活化为效应T细胞清除抗原,其中一部分转化为记忆性T细胞,分布在不同部位长期稳定存在。当少量相同抗原再次出现时,记忆性T细胞能迅速识别清除抗原,具有广泛的免疫监视作用,是构筑持久免疫力的重要因素之一。记忆性T细胞主要分为中央型记忆性T细胞(Central memory T cell)和效应型记忆性T细胞(Effector memory T cell),而效应型记忆T细胞在外周能够发挥更为强大和持久的抗原清除作用。已有研究通过体外刺激乳腺癌患者骨髓来源的记忆性T细胞使其具有抗肿瘤作用。据此,本研究提出,同种异体皮肤移植是否可以促使受体体内免疫环境向抑制肿瘤生长方向转化,产生抗肿瘤效应;记忆性T细胞是否与这种抗肿瘤效应相关;是否可以诱导出具有高效抗肿瘤作用的记忆性T细胞用于肿瘤的免疫治疗。第一部分同种异体皮肤移植抗B16黑色素瘤作用研究目的:探讨同种异体皮肤移植抗B16黑色素瘤作用。方法:将6周龄雌性Balb/c小鼠背部皮片移植到6周龄雌性C57BL/6小鼠背部,移植两个月后于C57BL/6小鼠右侧腹股沟皮下构建B16移植瘤。观察皮肤移植组(Skin-Transplantation,ST)和无同种异体皮肤移植组(Non-Transplantation,NT)C57BL/6小鼠皮下B16肿瘤组织生长速度、生存率;流式细胞术检测两组C57BL/6小鼠脾脏、淋巴结、肿瘤组织中CD4+CD44+CD62L+T 细胞(CD4+中央型记忆性 T 细胞,CD4+TCM)、CD8+CD44+CD62L+T 细胞(CD8+中央型记忆性 T 细胞,CD8+TCM)、CD4+CD44+CD62L-T 细胞(CD4+效应型记忆性 T 细胞,CD4+TEM)、CD8+CD44+CD62L-T细胞(CD8+效应型记忆性T细胞,CD8+TEM)频率差异;流式细胞术检测两组小鼠骨髓及肿瘤组织中CD11b+、LY6G+细胞(骨髓前体抑制细胞,MDSC),脾脏CD4+CD25+FOXP3+细胞(CD4+调节性T细胞,CD4+Treg)频率差异。酶联免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测两组小鼠外周血血清中趋化因子CXCL9、CXCL10及干扰素-γ(INF-γ)的含量,通过免疫组织化学(Immunological Histological Chemistry,IHC)检测肿瘤局部核增殖抗原(Ki-67)、血管密度(CD34)、凋亡信号(TUNEL)、趋化因子9(CXCL9)、趋化因子10(CXCL10)情况。磁珠分选获取来源于两组小鼠脾脏的高纯度效应型记忆性T细胞(CD4+TEM,CD8+TEM),对C57BL/6小鼠源性黑色素瘤B16细胞及C57BL/6小鼠源性肝癌Hepa1-6细胞进行细胞毒实验;使用纯度大于95%的效应型记忆性T细胞对荷B16肿瘤的C57BL/6小鼠经尾静脉过继治疗,于荷瘤后第7、14、21日治疗三次,观察各组小鼠肿瘤体积及生存率,同时对各治疗组C57BL/6小鼠所荷B16肿瘤组织进行免疫组化检测Ki-67,TUNEL检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:同种异体皮肤移植组C57BL/6小鼠所荷B16肿瘤组织生长受到抑制,生存时间较无移植组小鼠延长。同种异体皮肤移植组C57BL/6小鼠所荷B16肿瘤局部CD8+效应型记忆性T细胞(CD8+TEM)频率高于无同种异体皮肤移植组小鼠,肿瘤局部血管密度较低,核增殖抗原水平较低,TUNEL凋亡信号增高、趋化因子CXCL9及CXCL10水平均增高。皮肤移植组荷B16肿瘤C57BL/6小鼠外周血血清中CXCL9、CXCL10以及INF-γ水平均高于无同种异体皮肤移植组小鼠,差异有统计学意义。源于皮肤移植组C57BL/6小鼠脾脏的效应型记忆性T细胞具有抗B16肿瘤细胞作用,在过继免疫治疗中抑制B16肿瘤在C57BL/6小鼠体内生长,延长荷瘤小鼠生存时间。相应治疗组C57BL/6小鼠所荷B16肿瘤组织核增殖抗原信号Ki-67较低,凋亡信号较高,差异有统计学意义。结论:同种异体皮肤移植具有明显的抗B16肿瘤作用。同种异体皮肤移植可以诱导C57BL/6小鼠体内产生具有抗B16肿瘤作用的效应型记忆性T细胞。第二部分高杂交率DC/B16融合细胞扩增同种异体皮肤移植诱生效应型记忆性T细胞特异性抗B16黑色素瘤作用研究目的:高杂交率DC/B16融合细胞增强同种异体皮肤移植诱生的效应型记忆性T细胞特异性抗B16黑色素瘤作用。方法:取6周龄雌性C57BL/6小鼠长骨骨髓细胞,用含10 ng/mL小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及10 ng/mL小鼠白介素-4(IL-4)的RPMI1640完全培养基诱导树突状细胞成熟,在第5天时与B16细胞融合。DC使用CFSE染色,B16细胞使用PKH26染色,用高杂交率细胞融合方法将两者融合,细胞核使用DAPI染色,荧光显微镜检测融合效率。继续培养5天。从经过皮肤移植荷B16肿瘤的C57BL/6小鼠脾脏获取高纯度效应型记忆性T细胞(CD4+TEM、CD8+TEM),与DC/B16融合细胞共培养。经DC/B16融合细胞刺激及未经刺激的效应型记忆性T细胞作为效应细胞,对数生长期的C57BL/6小鼠黑色素瘤B16细胞C57BL/6小鼠肝癌Hepa1-6细胞作为靶细胞,按照1:1、3:1、9:1的效靶比分别进行细胞毒实验。收集效应细胞与B16肿瘤细胞共孵育上清液,通过酶联免疫吸附分析检测白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-10(IL-10)浓度。采用经过DC/B16融合细胞刺激及未经刺激的效应型记忆性T细胞经尾静脉过继治疗荷B16肿瘤的C57BL/6小鼠,于荷瘤后第7、14、21日治疗三次,分析各组小鼠B16肿瘤体积及生存率差异。免疫组织化学(Immunological Histological Chemistry,IHC)检测各组肿瘤组织中核增值抗原Ki-67,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡信号。结果:荧光显微镜观察计数融合细胞效率达80.1%,经过融合细胞体外刺激的同种异体皮肤移植诱生的效应型记忆性T细胞对B16细胞杀伤作用显著强于未经DC/B16融合细胞刺激组,对Hepa1-6细胞无明显杀伤作用,具有B16细胞特异性;其与B16细胞共孵育的上清液中白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度均高于未经DC/B16融合细胞刺激组。过继免疫治疗中,经DC/B16融合细胞刺激的同种异体皮肤移植诱生的效应型记忆性T细胞治疗组C57BL/6小鼠所荷肿瘤组织体积小于未经融合细胞刺激的记忆性T细胞治疗组小鼠,生存时间得到进一步延长,经过DC/B16融合细胞扩增的同种异体皮肤移植诱生的CD4+及CD8+效应型记忆性T细胞混合治疗组C57BL/6小鼠与PBS组相比,中位生存时间延长了 82.7%。免疫组织化学检测结果显示,经DC/B16融合细胞扩增的同种异体皮肤移植诱导的效应型记忆性T细胞治疗组C57BL/6小鼠所荷肿瘤组织中核增殖抗原Ki-67阳性信号明显低于其他组,凋亡信号TUNEL阳性信号高于其他组,差异有统计学意义。结论:通过C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞和C57BL/6小鼠来源B16黑色素瘤细胞构建的融合细胞体外扩增,可以扩增出特异性抗B16肿瘤的同种异体皮肤移植诱导的效应型记忆性T细胞。这些细胞能够分泌IL-2、INF-γ及TNF-α等多种细胞因子,在C57BL/6小鼠B16黑色素肿瘤模型内发挥高效抗肿瘤作用。