叶绿体是植物细胞中极为关键的细胞器之一,被誉为植物细胞进行生命活动的“动力工厂”。那么,对于在逆境胁迫下植物叶绿体在生理、生化等方面变化的研究具有深远的意义。课题组前期工作中,在关于UV-B辐射增强后导致的植物幼苗生物学功能损伤,以及He-Ne激光的抗逆防护效应方面做了大量工作。本研究将在前期研究成果的基础上,以冬小麦(Triticum aestivum L.)幼苗为研究对象,通过室内模拟UV-B辐射增强的环境条件,研究了UV-B辐射增强(10.08KJ/cm2)和低剂量He-Ne激光辐照(λ=632.8nm,5.23mW/cm2 min)对小麦幼苗叶绿体生理及蛋白质组学的影响,以期进一步深入阐明低剂量He-Ne激光处理对增强UV-B辐射后植物叶绿体损伤的修复效应及细胞学机理。该研究成果对于进一步完善He-Ne激光的抗逆防护效应具有重要的理论和实践意义。主要研究结果包括:(1)增强UV-B辐射会引起小麦幼苗叶绿体发育异常,导致叶绿体形态、超微结构和化学组成发生变化,叶绿体的光合作用效率降低,叶绿素荧光参数改变,低剂量的He-Ne激光辐照有效地缓解了UV-B辐射对小麦幼苗叶绿体产生的胁迫损伤效应。(2)增强UV-B辐射导致小麦叶片发生ROS积累,这是引起细胞毒性和细胞死亡的重要原因之一。这些ROS产物的形成主要是由于叶绿体受到UV-B胁迫而释放的,He-Ne激光辐照则可以减少小麦叶绿体ROS的释放,降低UV-B胁迫对小麦细胞造成的毒性效应。(3)本研究中通过对实验条件的探索与优化,建立了一套适于小麦叶绿体的分离纯化以及叶绿体蛋白质2DE电泳体系的方法,即采用30%,45%,60%蔗糖浓度的密度梯度离心法,获得了完整度与纯度均较高的叶绿体细胞器,TCA-丙酮沉淀法提取叶绿体蛋白后,选用pH4~7的17cm IPG线性预制胶条,上样量300μg/gel,12%SDS-PAGE胶浓度下进行2-DE电泳实验,分别进行了考染和银染显色,得到了分离效果与重复性良好的2-DE图谱。(4)经PD Quest软件分析后识别出400个左右较为清晰的蛋白质点,依据分析结果对30个显著表达差异的蛋白质点进行了MALDI-TOF-MASS肽质量指纹图谱分析,并结合Mascot搜库软件及UniprotKB/Swiss-prot蛋白功能检索,共鉴定出25个差异蛋白,它们主要参与了叶绿体中光合碳代谢、能量代谢以及抗氧化防御等重要生理过程。另外有2个为Uncharacterized protein,经过数据库检索,推测其分子功能与UV响应及防护相关。(5)选取与叶绿体光合、能量代谢以及抗氧化防御生理密切相关的6种蛋白进行Q-PCR,并与蛋白表达水平进行了比较分析。发现这几个蛋白点在转录水平的上、下调变化与其在蛋白表达水平的变化趋势基本一致,进一步验证了蛋白质组学的实验结果。(6)选取分子功能与UV-B防护相关的一个新蛋白,即UV-B响应蛋白基因(LOC100844138-UVB 2)为研究对象,设计引物,进行基因扩增和克隆,成功扩增获得了1752bp的目的基因条带。后期将进一步对目的片段进行测序检测,通过下游工程技术深入研究和验证其生物学功能。综上所述,增强UV-B辐射会改变小麦幼苗叶绿体的蛋白质表达谱,导致一些重要的抗性蛋白表达发生异常,活性氧代谢失衡,从而使叶绿体结构发生损伤,引起其生物学功能出现障碍。然而,低剂量的He-Ne激光辐照可以保护小麦叶绿体免受增强UV-B胁迫的伤害,激光的这一生物学效应的主要原因是由于He-Ne激光激活了部分UV-B抗性蛋白和UV-B损伤修复蛋白的表达,进而提高了小麦幼苗叶绿体的UV-B胁迫抗性和自我修复能力。