论文部分内容阅读
背景：MicroRNA是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，是内源性的调控基因，通过结合靶基因从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因来发挥其作用。microRNA对肿瘤发生、发展的影响，是目前研究的热点之一，有望成为一种对肿瘤诊断和治疗的靶点。恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)又称为恶黑，发病率占皮肤恶性肿瘤的第三位（6.8%～20%），其恶性度高﹑转移早，预后差，死亡率高。本实验应用基因芯片技术对A375恶性黑色素瘤细胞进行了分析，显示microRNA-192基因在恶性黑色素瘤细胞中高表达，本研究以microRNA-192基因作为实验目标，研究其在A375恶性黑色素瘤细胞中的作用。目的：探讨microRNA-192抑制物对A375恶性黑色素瘤细胞的作用。为进一步研究microRNA分子在A375恶性黑色素瘤细胞中的作用机制奠定基础。方法：1细胞培养将A375恶性黑色素瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基（含青霉素100U/ml，含链霉素100U/ml，PH7.2）中，放入37℃、5%CO2的培养箱内进行常规传代培养。2在倒置光学显微镜观察A375恶性黑色素瘤细胞分化及形态。3在MicroRNA-192抑制物（200nmol/L）转染A375恶性黑色素瘤细胞48小时后用实时定量PCR检测其microRNA-192基因的表达量与未转染细胞microRNA-192基因表达量的差异。4MTT比色分析法检测不同剂量microRNA-192抑制物（400nml/L,200nmol/L,100nmol/L）转染A375恶性黑色素瘤细胞后第1天、第2天、第3天对细胞增殖的影响。5应用Anexin-ⅴ-PI双染色检测转染后第二天A375恶性黑色素瘤细胞早期凋亡的变化，将实验分为正常细胞组，LipofectamineTM2000对照组，实验组（200nmol/L）。6运用统计软件SPSS13.0对数据进行处理，采用单因素方差分析，以ａ=0.05为显著性差异标准。结果：1未经任何处理过的A375恶性黑色素瘤细胞呈梭形或多角形，分布均匀，大小基本一致，增殖旺盛，核固缩现象较少见。2转染6小时后，microRNA-192抑制物（100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L）转染效率在80%-90%之间。3MicroRNA-192抑制物（200nmol/L）转染A375恶性黑色素瘤细胞48小时后，实时定量PCR结果显示，与转染前microRNA-192基因表达量相比明显降低。表明microRNA-192抑制物已成功转染A375恶性黑色素瘤细胞并部分沉默microRNA-192基因。4MTT比色分析法检测处理因素对A375恶性黑色素瘤细胞增殖的影响。正常细胞对照组和LipofectamineTM2000对照组之间无明显差异(P>0.05)。3组实验组与正常细胞对照组和Lipofectamin eTM2000对照组对照均有明显差异(P<0.05)，且随着microRNA-192抑制物浓度从100nmol/L、200nmol/L到400nmol/L，对细胞增殖的抑制率也增高。5用Anexin-ⅴ-PI双染色检测microRNA-192抑制物（200nmol/L）转染48小时后对A375恶性黑色素瘤细胞后的早期凋亡率与照组有显著性差异（P<0.05）。结论：1MicroRNA-192抑制物对A375恶性黑色素瘤细胞microRNA-192基因表达的抑制效果明显。2MicroRNA-192抑制物对A375恶性黑色素瘤细胞增殖有明显抑制作用。3用MicroRNA-192抑制物转染A375恶性黑色素瘤细胞后能诱导A375细胞早期凋亡。microRNA-192抑制物影响A375恶性黑色素瘤细胞的增殖凋亡，但其具体的作用机制需要进一步研究。