背景：肿瘤转移是恶性肿瘤患者治疗失败和死亡的重要原因。恶性肿瘤的90％是癌，癌早期主要通过淋巴道转移，淋巴结转移灶又可以成为晚期血道转移的桥头堡。对癌淋巴道转移机制的研究具有重要的理论意义和急迫的现实意义。但我们目前对癌淋巴道转移的分子机制还缺乏足够的了解。Hca-F和Hca-P是一对转移能力不同的小鼠肝癌细胞株，其中Hca-F细胞为高转移株Hca-P细胞为低转移株。且二者均特异性向淋巴结转移。当前研究不同生物学表型细胞间基因表达差异的主要技术手段有表达序列标签(EST)、基因表达系列分析(SAGE)、差异展示(DD-RTPCR)、代表性差异分析(RDA)、抑制性消减杂交(suppressive subtractive hybridization，SSH)、以及基因芯片基础上的技术(chip-based approach)等。抑制性消减杂交技术是1996年以后发展出来的一种建立在抑制性PCR与消减技术基础上的分离差异表达基因的方法，它既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用抑制性PCR高效的动力学富集，对分离低拷贝的差异表达基因效率极高。具有灵敏性高，假阳性率低，省时省力，价格低廉且不受种属限制的优点。目的：本研究试图以抑制性消减杂交技术分离Hca-F和Hca-P细胞间差异表达可能与癌淋巴道转移相关的基因，从而为进一步阐明肿瘤淋巴道转移分子机制奠定基础。方法：选用高低转移力小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P，以使用TRIZOL试剂的一步法分离Hca-F和Hca-P细胞的总RNA，再以结合有Oligo dT的微球作为分离介质，用亲和层析的方法从总RNA中分离mRNA。以所获两种细胞的mRNA为模板，同步逆转录合成cDNA。以Hca—P细胞的cDNA作为Driver，以Hca—F细胞的cDNA作为Tester构建抑制性消减杂交文库。将Tester的cDNA用识别4碱基的限制性内切酶消化后分为均等的两分，分别连接试剂盒提供的不同接头adaptor 1和adaptor 2R。分别加入过量的Driver cDNA 68℃杂交8小时，再合并两份杂交产物并加入新鲜变性的过量的Driver cDNA 68℃杂交16小时。杂交产物经过LA Taq DNA聚合酶补平末端后，以试剂盒提供的PCR Primerl作为第一次PCR的引物，以Nested Primerl和Nested Primer ZR作为第二次PCR的引物，通过抑制性PCR富集大量在Tester中高表达的差异表达基因的CDNAo然后将PCR产物插入T/A克隆载体，并通过热转化的方法转化大肠杆菌DH一SQ。如此即建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库。以PCR的方法比较看家基因G3PDH在消减前后的丰度差别进行消减效率的检测，以菌液PCR的方法检测随机挑选的白色菌落中插入片段的出现频率。用质粒提取试剂盒提取抑制性消减杂交文库中的重组质粒并进行序列分析。将测序结果进行整理，选取Nosted Primerl和Nested Primer ZR之间的序列，与Genebank Blast进行同源性比对。结果:经动物实验证明，实验所用Hca一F和Hca一P细胞具有稳定的淋巴结转移能力。提取的总RNA纯度较高，吸光度A26O/吸光度A28O为1.9，经1%琼脂糖凝胶电泳检测发现提取的RNA有清晰的285和185的条带，且285:185>2:1，说明RNA没有降解。所获帆NA为分子量大小不等的云雾状阴影，说明提取的mRNA质优量足。Hca一F和Hca一P细胞的cDNA与Rsal酶切后的Hca一F和Hca一P细胞的cDNA在1%琼脂糖凝胶上同时电泳，发现酶切后的cDNA片段明显小于酶切前的cDNA片段，说明酶切较完全。两轮消减杂交后的产物经巢式PCR扩增出了分子量大小不等的产物，消减后的PCR产物与消减前的PCR产物相比，片段变小，亮度减弱。以看家基因G3PDH的序列设计引物，用PCR的方法进行消减效率检测，发现在未消减样品中于PCR反应25循环时即可看见特异性扩增带，而在消减后样品中于PCR反应35循环才看见特异扩增带，说明经过两轮消减Tester和Driver中都存在的看家基因G3PDH的丰度大幅度下降。对随机挑选的160个可能含差异表达CDNA片段的白色菌落进行菌液PCR扩增，发现95%的白色菌落中含有大小不等的插入片段，分子量主要分布在100一700bp。对提取的重组质粒进行序列分析和同源性比对发现(公布部分数据)，所获的巧个序列中4个为已知基因，分别来自小鼠热休克蛋白、DNA解旋酶(helicase)、ribosomalprotein 513、ethanol indueed6基因:4个可能来源于新基因:3个片段分别与3个不同的EST序列具有同源性。结论:以抑制性消减杂交技术成功构建了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库，为今后高通量筛选癌淋巴道转移相关基因奠定了坚实的基础。对文库中所含部分cDNA片段的序列分析发现了小鼠热休克蛋白基因、DNA解旋酶、以及4个可能的新基因在高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间为差异表达。但这些己知基因或新基因能否成为肿瘤淋巴道转移的调控基因还需要进一步的研究工作证明。