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背景:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)的致残率比较高,通常会导致运动功能的障碍以及损伤。SCI不仅能导致损伤平面以下神经的运动支配以及感觉反馈的缺失,还可能引起包括呼吸、循环、泌尿以及生殖等多个器官和系统的功能功能障碍。目前常用的治疗主要包括低温治疗、药物治疗、手术治疗以及干细胞治疗等。虽然治疗SCI的技术手段在不断地进步,但是SCI患者的远期疗效仍然不尽人意,临床迫切需求新的治疗方法和手段。二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术相比之前的方法,费用更低、通量更高、速度更快,能够全面地从转录层面筛选鉴定与疾病相关的基因,为生命科学领域探索疾病机制奠定了技术基础。本研究通过mRNA和microRNA测序,并结合分子生物学技术,筛选与SCI损伤修复有关的基因,进而对其进行功能和机制研究。MicroRNAs是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过作用于靶基因参与生物体生殖发育、肿瘤发生发展,以及SCI修复等重要生命过程,且通过一些研究结果得到了证实,但该过程中的具体潜在作用机制仍不清晰,亟待开展进一步的研究和证实。Pp1和miR-6324大鼠脊髓损伤发生发展过程中表达量变化较大的基因。有研究显示其参与许多损伤中的炎症反应过程,但是在脊髓损伤中的作用尚不明确。目的:筛选鉴定参与SCI病理变化的潜在基因,挑选其中的关键基因,研究其在SCI治疗和修复中的功能和机制,以便为探索SCI治疗和修复的新的靶标分子,也为开拓SCI新的治疗路径和方法奠定理论基础。方法:第一部分:Pp1在大鼠SCI修复中的作用及其机制1.建立SCI大鼠模型:将30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)和SCI组,采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分系统,斜坡实验和电生理学检测对SCI后大鼠的运动神经功能进行评价;利用Green Fluorescent Nissl Stain标记神经元,检测SCI后脊髓神经细胞形态的变化情况,以此确认大鼠SCI模型是否成功构建。2.差异基因的筛查及分析:提取SCI和假手术大鼠模型中脊髓组织总RNA,利用转录组测序分析Sham组和SCI组mRNA表达谱。进行GO分析和KEGG分析,并结合qPCR验证转录组测序数据准确性。3.差异基因Pp1在大鼠SCI修复中的作用及其机制:设计合成siRNA,对SCI模型鼠损伤区注射,降低Pp1基因表达;20天后,采用BBB评分系统对大鼠的运动神经功能进行评价,观察其干预效果和SCI修复变化;使用qPCR、Western Blot、Green Fluorescent Nissl Stain和免疫荧光检测,评价SCI的修复效果,初步揭示Pp1基因在SCI修复中的功能和机制。第二部分:miR-6324在大鼠SCI修复中的作用及其机制1.差异miRNAs的筛查及分析:将构建成功的SCI损伤模型动物分为两组,1d组为损伤1天后取材组,5d组为损伤5天后取材组,到达时间点后取脊髓组织检测;通过miRNA测序和生物信息学分析比较1d组5d组miRNAs表达谱差异,进行GO分析、KEGG分析。筛选出相关基因miR-6324;用qPCR测定miR-6324靶基因PIK3CD、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1、CASP3 和 IL1A 在 1d 组 5d 组中的表达水平。2.miR-6324对PC-12细胞的增殖和凋亡的作用及其机制:分别转染miR-6324增强子或抑制子于PC-12细胞,用qPCR测定转染后细胞中的miR-6324表达水平;同时用qPCR和Western Blot检测各组细胞中caspase 3的表达水平,并测定各组细胞活力。运用生物信息学预测miR-6324靶位点,Western Blot测定PIK3CD的表达变化,构建PIK3CD 3’-UTR及其突变体的报告基因表达载体;运用荧光报告基因技术对PIK3CD是否是miR-6324靶点进行验证。3.miR-6324在大鼠SCI修复中的作用及其机制:根据miR-6324设计合成siRNA,对对SCI模型鼠损伤区注射,降低miR-6324表达,采用BBB评分系统对大鼠的运动神经功能进行评价,观察其干预效果和SCI后功能恢复;用Western Blot、Green Fluorescent Nissl Stain和免疫荧光检测,评价SCI的修复效果,初步揭示miR-6324在SCI修复中的功能和机制。结果:第一部分:Pp1在大鼠SCI修复中的作用及其机制1.模型的构建:和Sham组相比,SCI组的行为学、电生理和形态学结果显示脊髓损伤明显,表明SCI模型构建成功。2.差异表达基因的筛查及分析:RNA测序结果显示,SCI组与Sham组差异表达mRNA数目为330个。其中238个mRNA上调,92个mRNA下调。上调最为显著的基因是Pp1,其表达水平显著高于对照组(均P<0.05),而且qPCR和WESTERN BLOT验证结果与测序结果一致。3.Pp1的作用及其机制:干预差异基因Pp1组SCI恢复效果明显优于未干预Pp1的对照组,而且两组行为学和电生理检测结果差异明显,免疫荧光定位神经元形态和数量也存在显著差异(均P<0.05)。qPCR和WESTERN BLOT结果显示:沉默Pp1基因表达后IL-6、IL-17和IL-23表达显著下降,而p-STAT3基因表达则显著上升(均P<0.05),提示差异基因Pp1表达水平与SCI损伤区的炎症反应密切相关。第二部分:MiR-6324在大鼠SCI修复中的作用及其机制1.差异MicroRNA的筛查及分析:SCI 1天和5天后的MicroRNA测序和生物信息学分析鉴定结果显示,18个SCI相关基因间miRNAs表达谱存在差异。其中上调的 miRNAs 有 3 个(分别为 rno-miR-10b-5p、rno-miR-375-3p、rno-miR-496-3p),下调的 miRNAs 有 15 个(fo1d change>1.5)(分别为 rno-miR-122-5p、rno-miR-18a-5p、rno-miR-19a-3p、rno-miR-208a-3p、rno-miR-147、rno-miR-184、rno-miR-293-5p、rno-miR-199a-3p、rno-miR-142a-3p、rno-miR-6324、rno-miR-199a-5p、rno-miR-3120、rno-miR-214-3p、rno-miR-130b-5p、rno-miR-21-5p),rno-miR-6324 下调最为显著。2.miRNA-6324对PC-12细胞增殖和凋亡的作用及其机制:qPCR测定结果显示,过表达miRNA-6324的PC-12细胞凋亡较对照组明显(均P<0.05),其Caspase 3蛋白表达上调,细胞增殖能力下降(均P<0.05);生物信息学预测结果显示,miRNA-6324靶向PIK3CD基因,而且通路双荧光素酶报告基因系统验证结果显示,miRNA-6324和PIK3CD基因相互作用,提示miRNA-6324可能靶向于PIK3CD基因影响SCI的修复。3.miR-6324在大鼠SCI修复中的作用:miR-6324干扰治疗脊髓损伤大鼠的疗效分析结果显示,干扰治疗组行为学、电生理和形态学恢复效果明显优于对照组(均P<0.05),说明miR-6324低表达对SCI的治疗和修复具有良好的疗效。结论:1.大鼠脊髓损伤后与未损伤大鼠相比,损伤区蛋白表达有明显的变化,主要是炎症相关蛋白。2.下调Pp1基因可以降低损伤区的炎症反应,从而促进SCI治疗和修复过程。3.脊髓损伤后1天和5天相比,脊髓损伤区miRNAs表达有明显的变化。4.miRNA-6324通过靶向PIK3CD介导细胞凋亡过程,参与SCI的过程,下调miRNA-6324可以促进SCI修复。5.Pp1和miR-6324有望成为SCI治疗和修复的新的靶标分子,可以作新的SCI治疗方法。