苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种杆状的革兰氏阳性菌,其产生的伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目等昆虫具毒杀活性,Bt制剂是目前应用最为成功的微生物农药。同时,Bt携带的杀虫基因也被成功用于构建抗虫转基因作物。由于长期使用导致昆虫抗性的产生以及新型害虫造成更大的危害,更多Bt资源的挖掘一直备受研究者关注。而高效的分类鉴定系统是新型Bt资源挖掘的关键。传统的基于H-抗原(即鞭毛抗原)免疫反应的H-血清型分型手段被应用于上万株Bt菌株的分类与鉴定,然而这种方式由于操作繁琐已被停止使用。本研究拟从多个层面探究Bt H-抗原的遗传决定因子,从而为开发高效的Bt分类鉴定系统提供理论基础。同时,Bt H-抗原遗传决定机制的阐明也能够为其他利用H-血清型进行分类和鉴定的细菌提供依据。本研究主要从Bt鞭毛合成基因簇多样性、参与H-抗原决定的关键基因的转录情况、关键基因的翻译情况以及翻译后修饰情况等层面系统性地了解Bt H-抗原的遗传基础。主要结果如下:(1)Bt以及所属的蜡状芽胞杆菌群的鞭毛合成基因簇存在丰富的多样性。为了解Bt菌株H-血清型基因层面的遗传多样性,蜡状芽胞杆菌群中的蜡状芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌也被纳入分析的范围。通过比较鞭毛合成基因簇,我们将三者的鞭毛蛋白决定基因进行了系统发育分析,发现蜡状芽胞杆菌群成员的鞭毛合成基因簇具有丰富的多样性,其中Bt与蜡状芽胞杆菌的鞭毛合成基因簇几乎无异,但与蕈状芽胞杆菌差异较大。然而三者的编码的鞭毛蛋白基因序列及鞭毛蛋白基因的拷贝数无明显差异。据此推测,蜡状芽胞杆菌群菌株具有类似的H-血清型遗传基础。对于Bt而言,鞭毛蛋白的基因序列和拷贝数能够部分反映其H-抗原的多样性,预示着Bt不同的H-抗原的形成受多个层次的影响。(2)包括前期证明无鞭毛结构的所有Bt菌株的鞭毛蛋白基因都能够正常转录,预示着Bt的H-抗原决定发生在基因表达的其他层次。由于许多菌株具有相似的鞭毛合成基因簇结构和鞭毛蛋白基因序列,但H-抗原组成却存在着较大的差异,我们首先探究基因表达水平的差异对H-抗原组成的影响。对序列一致性较高但血清型不同的菌株的鞭毛蛋白基因进行了转录分析,并对它们的鞭毛蛋白进行了蛋白成分分析,发现所有存在鞭毛结构的Bt菌株的鞭毛蛋白基因都能够转录,而无鞭毛的菌株虽然具有与其他菌株相同的鞭毛合成基因簇,其鞭毛蛋白基因也能够被转录,却无法在细胞外检测到其鞭毛蛋白,预示着基因的转录产物没有被翻译成蛋白或鞭毛蛋白未能分泌到胞外并参与鞭毛丝的组装,说明Bt的H-抗原组成受翻译或翻译后水平调控影响。(3)尽管许多Bt基因组中存在多个拷贝的鞭毛蛋白合成基因,然而一般的菌株只表达其中一种,说明翻译水平对于H-抗原组成的决定至关重要。为在翻译水平探究不同血清型鞭毛蛋白基因的表达情况,我们对提取的鞭毛蛋白进行了基于质谱分析的蛋白质组测序,结果显示:所有Bt菌株所提取的鞭毛蛋白样品中都仅检测到一种鞭毛蛋白,包括鞭毛蛋白基因为多拷贝的Bt菌株。这些菌株所表达的鞭毛蛋白往往是其基因组中序列长度最长的,即Hag蛋白。当该菌株未编码hag基因时,则普遍表达另一种鞭毛蛋白Fla B。当Hag或Fla B为多拷贝时,Bt则倾向于表达序列长度较长的Hag A或Fla B1。(4)序列上具有相似鞭毛蛋白基因而血清型不同的Bt菌株所编码的鞭毛蛋白翻译后修饰位点存在较大差异,预示着翻译后修饰对于这些Bt的H-抗原组成起着决定性作用。为探究蛋白翻译后修饰对于H-抗原组成的影响,我们利用蛋白质质谱分析手段对具有相同或者高度相似的鞭毛蛋白基因序列相似性的而血清型不同的Bt的鞭毛蛋白进行分析,发现在不同血清型Bt菌株的鞭毛蛋白中普遍存在四种翻译后修饰现象,即乙酰化修饰、O-连接糖基化修饰、泛素化修饰和磷酸化修饰。并且,在鞭毛蛋白基因具有较高序列一致性的Bt菌株中,翻译后修饰位点也存在着较大的差异。这些结果说明翻译后修饰直接决定着许多Bt的H-抗原组成的多样性。(5)不同血清型亚型的H-抗原组成多样性在序列上主要由鞭毛蛋白基因的V区决定,在调控上主要在翻译和翻译后水平受到影响。由于鞭毛蛋白基因是两端保守,中央多变的序列结构,因此决定H-抗原组成的序列或位点主要位于鞭毛蛋白V区。考虑到翻译后修饰可通过调控鞭毛蛋白序列V区影响H-抗原组成的多样性,我们展示了鞭毛蛋白V区序列高度一致Bt菌株存在差异的位点、序列和修饰位点,对这类菌株的H-抗原决定因子进行了分析和推测,发现在血清型H3ac、H3ad、H3ade、H4ac、H5ab、H7、H9、H23、H25、H26、H31、H37、H41和H42中存在鞭毛蛋白基因和鞭毛合成基因簇结构完全相同的现象,暗示这些血清型的H-抗原组成可能是由翻译后修饰决定的。在血清型H20ab、H20ac、H27和H28ac中虽然存在鞭毛蛋白基因高度相似的现象,但鞭毛合成基因簇中的flg E基因及翻译后修饰位点存在差异,暗示这些血清型的H-抗原组成可能是由flg E或翻译后修饰决定的。其他血清型的H-抗原组成可能是由V区序列的差异决定的。本研究从基因水平、转录水平、翻译后水平和翻译后修饰水平对不同血清型Bt菌株的H-抗原决定因子进行了分析和推测。揭示了不同血清型Bt菌株鞭毛蛋白基因的表达情况及可能决定H-抗原种类的位点、序列和翻译后修饰位点,也发现了可能影响H-血清型的其他基因,为Bt H-血清型分型系统的完善及其他菌种的分类提供了新的思路和见解。