萜类香料在食品、医疗等领域上有着重要的作用,市场需求量快速增长。随着合成生物学的发展,在微生物中重构合成途径可实现萜类香料的生物合成,能极大的缓解市场需求压力。特别是,微生物法生产的萜类香料已被欧美立法认定为天然产物,更显示出其巨大的潜力。然而,当前缺乏高效的底盘细胞,大部分萜类香料通过微生物异源合成产量低或只是简单的中间体。作为GRAS的解脂耶氏酵母,由于其在合成以乙酰辅酶A为前体的脂类或萜类化合物上的优势,是一种潜在的高效底盘细胞。因此,本研究以萜类香料β-紫罗兰酮的高效生物合成作为切入点,利用模块化代谢工程方法和发酵优化策略,以挖掘解脂耶氏酵母成为新型萜类香料细胞工厂的潜力。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除解脂耶氏酵母ku70和ku80两个基因,获得高同源重组效率的解脂耶氏酵母工程菌株YLBI0003,其对14.5 kb长片段DNA的整合效率达到53%。接着选取来源于Mucor circinelloides的car B、car RP基因和来源于Petunia hybrid的CCD1基因组成β-紫罗兰酮合成途径,并对该合成途径的基因元件进行组装、整合到YLBI0003的基因组r DNA位置上,获得合成β-紫罗兰酮的出发菌株YLBI0004,摇瓶水平产量为3.5 mg/L。采用模块化思路,以重要代谢中间物乙酰辅酶A和GGPP为节点,将整个β-紫罗兰酮合成途径分为三个模块。模块一:乙酰辅酶A合成模块;模块二:GGPP合成模块;模块三:β-紫罗兰酮合成模块。首先是GGPP合成模块的优化。在该模块中,t HMG1和GGS1是关键酶,两者的过表达可以将β-紫罗兰酮产量提高15.5倍。整合GGPP合成模块的全部9个内源基因获得工程菌株YLBI3017,其β-紫罗兰酮产量为152.9 mg/L,较出发菌株YLBI0004提高43.7倍。进而,研究乙酰辅酶A合成模块的优化,通过引入来源于Bifidobacterium breve磷酸转酮酶以及来源于Bacillus subtilis磷酸转乙酰酶组合的磷酸转酮酶途径,可将β-紫罗兰酮产量提高到202.2 mg/L。再而,对β-紫罗兰酮合成模块的拷贝数和CCD1关键酶进行优化,发现增加一个β-紫罗兰酮合成模块的拷贝数可提高β-紫罗兰酮产量到220.7 mg/L(菌株YLBI3118,18.1 mg/g DCW)。此外,引入CCD1(K164L)突变体的工程菌YLBI3120或融合了胞内膜锚定标签的lck-CCD1的工程菌YLBI3121,进一步有效提高了β-紫罗兰酮产量,分别达到360.9 mg/L(15.9 mg/g DCW)和354.0 mg/L(16.5 mg/g DCW)。上述突变体或融合蛋白被报道提高了CCD1酶的膜亲和性、进而提高了对聚集在胞内膜的β-胡萝卜素的裂解效率。进一步,以YLBI3118为发酵菌株,进行β-紫罗兰酮的发酵优化。在摇瓶水平上对培养基进行考察,发现葡萄糖为最优碳源、胰蛋白胨为更优氮源,优化后β-紫罗兰酮的产量提高到358.4 mg/L(19.2 mg/g DCW),且如进行氮源限制时会导致β-紫罗兰酮产量显著降低了154%。在3-L发酵罐的研究中,发现培养基的溶氧水平是影响β-紫罗兰酮产量的重要因素,推测是因为CCD1裂解β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮是一个需要氧气参与的反应。在15%的最优溶氧条件下,β-紫罗兰酮产量约1 g/L,比出发菌株提高约280倍,为目前微生物法生成β-紫罗兰酮的最高水平。本论文研究主要创新点在于发现通过引入磷酸转酮酶途径增加胞质中乙酰辅酶A的供应是提高β-紫罗兰酮产量的有效策略,培养基中溶氧水平对β-紫罗兰酮产量有重要的影响,实现β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母的高产,这些为萜类香料的高效合成提供新的思路与平台菌株。