1研究背景对于理想的骨科植入物材料而言,优异的力学性能、生物相容性、骨诱导特性缺一不可。目前,钛合金、不锈钢等金属是临床上最常用的内固定植入物材料。由于此类金属材料刚性过高而产生“应力遮挡”效应,导致远期植入物松动,同时还引起金属过敏、植入物周围炎症反应等并发症,许多患者需要接受二次手术取出内固定植入物,增加患者痛苦,消耗宝贵的医疗资源。而聚乳酸、可降解镁合金等材料,由于降解产物导致局部炎症反应甚至皮下气肿,其应用也受到了限制。纳米材料和纳米技术在众多领域应用广泛,也是生物医学领域研究的热点。本研究团队的主要工作集中在骨组织工程纳米材料的合成及其在生物医学方面的应用,在过去的十余年中,对纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide 66,n HA/PA66)及其改性材料进行了大量基础和临床研究,研制了基于此类材料的接骨螺钉、接骨板等内固定植入物,但由于复合材料刚性较强,韧性不足作,植入体内后存在断裂风险,因此,继续寻求合适的生物材料用于提升内固定植入物的力学、生物学性能,是亟待解决解决的问题。石墨烯是十年来最热门的纳米材料之一,由于其惊人的特点和优良的性能,在物理学、材料学、化学、能源、生物医学等领域受到广泛关注。石墨烯/高分子纳米复合材料是石墨烯最具希望的应用之一,即使少量的添加石墨烯,也能显著增强高分子材料力学、电学、热学等方面的性能。聚酰胺66(Polyamide 66,PA66)是“五大工程塑料”之一,具有耐磨损、抗腐蚀、力学性能好等特点,同是还具有与人体胶原蛋白相似的化学结构,本研究团队的前期实验已经证明了其具有良好的生物相容性,即便长期植入体内,也不易引起异物反应。本文结合所在团队的研究背景,以石墨烯、纳米羟基磷灰石和PA66为原料,制备了石墨烯/聚酰胺66复合材料(Graphene-incorporated polyamide 66,G/PA66)以及石墨烯/纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(graphene reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66,G/n HA/PA66)复合材料,并对其体外、体内生物活性功能进行观察,对其生物相容性进行评估,探讨其作为骨科植入材料的可行性。2研究目的(1)制备石墨烯/聚酰胺66复合材料(Graphene-incorporated polyamide 66,G/PA66);(2)研究G/PA66复合材料的结构特征、力学性能;(3)在体外研究G/PA66复合材料对骨髓间充质干细胞粘附、增殖、成骨分化的影响及生物相容性;(4)评估G/PA66复合材料接骨螺钉体内生物活性和生物相容性,探讨G/PA66作为骨科植入物材料的可行性;(5)制备石墨烯/纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(graphene reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66,G/n HA/PA66)复合材料并对其进行表征;(6)评估G/n HA/PA66复合材料的生物相容性。3方法(1)使用溶液复合法制备G/PA66纳米复合材料,并通过旋涂制备用于细胞实验的复合材料基底,通过注塑制备力学测试样条和接骨螺钉。原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)、拉曼光谱(Raman spectrum)、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、场发射扫描电子显微镜(Field emission scanning electron microscopy,FESEM)、力学测试等对复合材料进行表征,观察复合材料的结构特征和力学性能。同时,通过分光光度法检测G/PA66对β-甘油磷酸和地塞米松的吸附能力。(2)将G/PA66复合材料作为小鼠骨髓间充质干细胞系(C3H10T1/2)培养的基底,通过细胞骨架及黏附蛋白免疫荧光染色、FESEM观察,研究复合材料对细胞形态、粘附的作用,通过定量实时聚合酶链锁反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)对粘附分子、连接蛋白等相关基因进行检测,以及流式细胞术,进一步研究复合材料对细胞增殖及细胞周期的影响。并评估复合材料的细胞毒性。(3)进一步研究G/PA66复合材料在C3H10T1/2成骨分化过程中的生物活性作用。诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,通过茜素红染色,检测细胞产生的钙盐沉淀;诱导C3H10T1/2细胞成脂分化,通过油红O染色,检测细胞产生的脂肪。并通过q RT-PCR检测诱导成骨分化过程中的成骨分化相关基因,进一步评估G/PA66对C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。(4)在G/PA66体外生物活性研究的基础上,进行体内植入的相关研究。将G/PA66复合材料接骨螺钉植入犬股骨髁内,PA66及不锈钢螺钉作为对照。通过微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,micro-CT)和组织学检测,评估复合材料周围骨组织生长情况;通过检测拧出螺钉所需扭矩,评估植入物与骨组织结合紧密程度。通过血清学检测和总要脏器、植入物周围软组织的组织学观察,评价G/PA66螺钉作为植入物的体内生物相容性。(5)通过溶液复合法和注塑法得到G/n HA/PA66复合材料,通过SEM、XRD对其结构特征进行观察,通过测试复合材料的弯曲强度、拉伸强度、断裂增长率、弹性模量,评估其力学性能。(6)通过CCK-8实验、荧光染色评估G/n HA/PA66复合材料的体内生物相容性,通过茜素红染色、q RT-PCR检测探究G/n HA/PA66在C3H10T1/2细胞成骨分化过程中的作用,将G/n HA/PA66复合材料接骨螺钉植入犬股骨髁内,通过对肝、脾、肾、脑、植入物周围软组织进行组织学观察,评估其体内生物相容性。4结果(1)AFM检测结果表明,石墨烯明显改变了PA66表面的纳米形貌。含有0.05%、1%、5%(w/w)石墨烯的复合材料基底表面粗糙度分别为48.904±2.273 nm、81.025±21.615 nm、119.033±11.158 nm,高于PA66(18.109±0.733 nm)。拉曼光谱检测观察到G/PA66和石墨烯均出现典型的G峰(~1600cm-1)和D峰(~1350cm-1),而PA66拉曼光谱在上述位置无明显峰出现,验证了G/PA66中石墨烯的存在。通过XRD研究石墨和石墨烯的微观结构,石墨在2θ=26.2°出现尖锐的衍射峰,层间距为0.33nm,而石墨烯没有出现明显的衍射峰。G/PA66与PA66相比XRD曲线形态相似,均在~20.0°和~23.9°出现PA66典型的衍射峰,而并未在26°出现石墨的典型衍射峰。SEM检测结果表明,石墨烯在复合材料中分散良好。G/PA66复合材料抗拉强度达到62.73±2.10 MPa,屈服强度59.56±2.78 MPa,杨氏模量0.96±0.06 GPa,分别比PA66提升了53.41%、48.31%和81.13%。(2)细胞接种4小时后,扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察发现PA66上的细胞为圆形,细胞骨架不清晰,而G/PA66上的细胞扁平,表面粗糙,伸出更多伪足,细胞骨架清晰,细胞周围有少量细胞黏着斑出现;24小时后,PA66组细胞仍旧体积较小,且基本呈圆形,伪足较少,可观察到少量细胞黏着斑,而G/PA66组基底已被层状、铺展良好、相互融合的细胞覆盖,细胞骨架染色强烈,细胞周围有密集的细胞黏着斑,表现出更好的细胞间相互作用及细胞-材料之间的粘附。在m RNA水平,Integrinα1以及cx43在G/PA66组被显著上调,具有统计学意义(P<0.05)。而Integrinβ1在两组间的差别没有统计学意义(P>0.05)。(3)流式细胞术检测结果发现,G/PA66可以使更多细胞进入S期和G2/M期。G0/G1期、S期、G2/M期细胞在PA66组分别为81.07%、7.16%、11.77%,而在G/PA66组,则分别为62.49%、11.98%、25.52%。在G/PA66的作用下,Cyclin A2,B1,D1以及E1的m RNA水平与对照组相比,显著上调,有统计学意义(P<0.05),Cyclin C的表达在两组间的差异没有统计学意义(P>0.05)。(4)CCK-8检测结果表明,G/PA66提取液与阴性对照组相比,吸光度无显著差异(P>0.05),而阳性对照组与其余两组相比,吸光度显著降低(P<0.05)。(5)培养C3H10T1/2细胞14天后,茜素红染色结果表明,在普通培养基条件下,各组仅可见少量红色,大体观察G/PA66组颜色比PA66组略微增多,提取颜色后定量分析,两组吸光度分别为0.29±0.07(PA66)和0.31±0.12(G/PA66),差异无统计学意义(P>0.05)。在诱导成骨分化培养基条件下,G/PA66组钙盐沉淀量多于对照组,提取颜色后经定量分析,PA66组吸光度1.52±0.12,G/PA66组吸光度2.07±0.09,差异显著(P<0.05)。在分子水平,细胞在材料上培养7天、14天,使用诱导成骨分化培养基情况下,G/PA66组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OC)、I型胶原(Collagen type I,COL-I)m RNA表达显著上调(P<0.05),过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)m RNA表达显著下调(P<0.05)。使用普通培养基情况下,上述基因表达情况在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。采用微量分光光度计测量溶液中促进成骨分化的化学物质浓度变化,从吸附等温线上可以看出,G/PA66吸附地塞米松、β甘油磷酸的能力高于PA66。(6)诱导C3H10T1/2细胞成脂分化14天后,油红O染色结果表明,PA66组脂滴聚集面积为142.0±50.73μm 2/细胞,G/PA66组为25.48±13.99μm 2/细胞,G/PA66组的脂滴聚集显著少于PA66组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)将G/PA66螺钉植入犬股骨髁内,术后4周观察硬组织切片标本,G/PA66周围骨小梁与植入物直接接触,连接紧密,骨-植入物接触率(Bone-implant contact,BIC)为76.95±4.67%,而不锈钢螺钉与骨小梁之间的界面可见较大缝隙,BIC为52.14±9.43%,两者BIC差异显著(P<0.05)。Micro-CT扫描对植入物周围骨组织进行定量分析,并三维重建,结果表明,G/PA66植入物周围骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)比对照组(PA66)高87.9%、33.3%、44.1%,骨小梁分离度(Tb.Sp)比对照组低32.2%,统计学差异显著(P<0.05)。通过扭力检测计测量植入物-骨界面断裂时的最大扭矩,术后1周G/PA66与PA66组无显著差异(P>0.05),术后24周,G/PA66(29.6±3.47 Ncm)与骨组织结合强度显著高于对照组(15.8±5.22 Ncm)(P<0.05)。(8)接骨螺钉植入动物体内12周后,G/PA66螺钉组血清肌酐(Creatinine,Cr)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT),以及C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)与对照组(不锈钢螺钉)相比均无显著差异(P>0.05)。肝、肾、脾组织学观察,两组也均未见明显异常。在植入物周围软组织的组织学观察中,发现不锈钢螺钉组与G/PA66螺钉组相比,有较多炎性细胞在局部聚集。(9)SEM、XRD检测结果表明,石墨烯和纳米羟基磷灰石在聚酰胺66中分散性良好,力学测试结果表明,G/n HA/PA66抗拉强度为62.06±0.52 MP,弯曲强度为85.27±1.98 MPa,杨氏模量1.37±0.03GPa,断裂增长率5.31±0.36%,分别比n HA/PA66提高49.14%、17.12%、21.24%和31.11%(P<0.05)。(10)C3H10T1/2细胞与G/n HA/PA66复合材料共培养1、3、7天进行CCK-8检测,各组OD值随时间推移而增加,G/n HA/PA66共培养的细胞比对照组(n HA/PA66)具有更高的代谢活性(P<0.05),肌动蛋白荧光染色法观察结果表明,与G/n HA/PA66共培养4小时后,C3H10T1/2细胞铺展和延伸良好,伸出伪足,而对照组细胞体积更小,伪足较少,共培养24小时、72小时后,两组细胞密度均增加,延伸、铺展良好,与G/n HA/PA66共培养的细胞密度更大,细胞骨架更明显。在诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的过程中,G/n HA/PA66能提高钙盐沉淀量,在分子水平,碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)m RNA表达被显著上调(P<0.05)。同时,G/n HA/PA66材料植入犬体内16周后,组织学观察肝、脾、肾、脑、植入物周围软组织,未见明显异常。5结论使用溶液复合法制备的G/PA66材料和G/n HA/PA66,具有良好的分散性,石墨烯能提高PA66表面的粗糙度,并且能增加复合材料的力学性能。G/PA66具有促进C3H10T1/2细胞在其表面粘附、铺展、延伸、增殖、成骨分化的功能,植入犬体内时,具有促进骨-植入物界面骨质生长和重塑的作用。G/n HA/PA66具有促进C3H10T1/2细胞粘附、增殖、成骨分化的作用。G/PA66和G/n HA/PA66复合材料在体内、外均有良好的生物相容性。