甘蓝型油菜是世界上最重要的油料作物之一,高含油量、高蛋白含量也一直是油菜育种家们共同关注的育种目标。在相同遗传背景下,黄籽油菜比黑籽油菜具有种皮薄,蛋白质和含油量高等优点,因此,黄籽甘蓝型油菜品种的选育是研究的一个热点问题。由于甘蓝型黄籽性状属于典型的数量性状,易受光照、温度、成熟度和收获时间等诸多因素的影响,具体的遗传机理尚不明确。因此,本研究利用复合区间作图法对高世代重组自交系多年多点环境中的粒色进行了QTL分析,结果在A05染色体上定位到一个与粒色性状相关联的修饰QTL位点,再结合重测序、RNA-Seq和qRT-PCR等技术方法对该修饰QTL区间内的候选基因进行了鉴定分析,共筛选到4个可能与粒色相关的候选基因;最终分别构建了这些候选基因的过表达载体和RNAi表达载体,通过遗传转化拟南芥和甘蓝型油菜对候选基因的基本的生物学功能进行验证。具体研究结果如下:1甘蓝型油菜粒色修饰QTL定位分析以GH06作为黄籽母本,中油821作为黑籽父本,杂交后代通过“单粒传法”连续自交多代构建的高世代重组自交系群体为材料,通过复合区间作图法(CIM)对多年多点环境中的粒色进行QTL分析,发现在A05染色体上检测到一个稳定的粒色性状相关的修饰QTL位点,单个QTL可解释1.38%-5.53%的表型变异;通过将紧密连锁的SNP标记mapping到甘蓝型油菜“Darmor-bzh”参考基因组上,发现该修饰QTL(BnSCA05)对应于A05染色体上13Mb-16Mb区间内(<3Mb)。2粒色相关候选基因的筛选与鉴定根据已测序完成的甘蓝型油菜“Darmor-bzh”基因组的注释信息,发现该区间内共包含277个注释基因。根据候选基因在24份重测序甘蓝型油菜中的变异情况,共筛选出40个在不同黄黑籽甘蓝型油菜中存在一致性变异位点的差异候选基因。随后,利用三对黄、黑籽甘蓝型油菜近等基因系材料对40个候选基因中的变异位点进行了同源克隆验证,基因同源比对的结果显示有4个基因在多对黄黑籽材料间存在规律性的碱基突变。BnSCA05-14基因在一个黑籽材料(B1)中有片段缺失,在另外两个黑籽材料(B2,B3)中存在碱基突变,但是氨基酸序列未发生突变;BnSCA05-17基因在2个黑籽材料(B1,B2)中第15个碱基序列发生了缺失突变。BnSCA05-18基因在黄籽材料(Y1,Y2,Y3)中序列一致,在黑籽材料(B2)中多处发生突变。BnSCA05-03基因在两对材料中(Y1,Y2,B1,B2)的多处位点发生突变。因此,我们将这4个基因列为候选基因,并进行了相关功能初步分析。3候选基因的功能分析本研究成功构建了候选基因(BnSCA05-03,BnSCA05-14,BnSCA05-17,BnSCA05-18)的超量表达载体,通过花序浸染法遗传转化拟南芥,并成功获得候选基因超量表达的T2代拟南芥植株系。通过对转基因拟南芥植株表型分析发现,与野生型拟南芥相比,OVBnSCA05-14,OVBnSCA05-17和OVBnSCA05-03株系的茎表皮颜色变紫,而OVBnSCA05-18株系的茎表皮与野生型一致。说明BnSCA05-14,BnSCA05-17和BnSCA05-03可能影响参与了类黄酮代谢途径;利用超景深显微镜对T2代拟南芥种子表型分析发现,与野生型相比,转基因株系OVBnSCA05-14,OVBnSCA05-17和OVBnSCA05-18的种子表皮颜色变深,OVBnSCA05-03株系种子表型变化不显著,说明超量表达BnSCA05-14,BnSCA05-17,BnSCA05-18基因可能通过参与影响种皮中类黄酮代谢途径而导致种皮颜色的变化,其具体的机理仍需要进一步分研究。4候选基因的启动子分析利用Gateway的方法分别构建了候选基因启动子的缺失表达载体,对候选基因的表达特异性及表达强度进行分析。结果表明,瞬时转化烟草后经GUS组织化学染色发现,仅基因BnSCA05-03全长启动子在瞬时转化烟草的叶片呈现环形的蓝色带。当启动子片段缩短时(-353bp),该现象缺失,说明BnSCA05-03基因启动子(-543bp--353bp)可能存在核心元件影响基因在组织中的特异性表达。目前,候选基因启动子核心元件的鉴定工作仍在进行中。5候选基因遗传转化甘蓝型油菜为了验证候选基因(BnSCA05-14,BnSCA05-17,BnSCA05-18和BnSCA05-03)在甘蓝型油菜中具体的生物学功能,通过下胚轴浸染的方法将已构建的候选基因超量表达载体及RNAi表达载体分别遗传转化转化黄、黑籽性状表现稳定的甘蓝型油菜(GH30和中双11)。甘蓝型油菜转基因植株正处于幼苗分化阶段,其转基因植株的鉴定和候选基因的功能分析工作将在后续的研究工作中完成。