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为获得月季新异花色,有效调控花色素代谢途径,需要在月季转基因研究中,首先选择高效的组织特异性的启动子,以提高外源基因在转基因植物中的表达效率。同时为了使后续转基因研究的更为深入,使外源基因在植物受体中表达调控的更为精准,应当尽量避免重复使用相同序列的启动子片段以减小造成基因沉默的风险。本研究旨在克隆得到月季花组织特异性的启动子,使其驱动外源基因在月季花组织中高效的表达,通过对其进行嵌合增强子的改造,为多基因表达载体的构建提供有效的调控元件,以期达到增强组织特异性启动子表达活性的目的。本研究取得的主要结果如下:1.月季花快速繁殖体系的建立以“卡罗拉”月季当年生枝条中段(半木质化)的带芽茎段为外植体,采用MS为基本培养基,添加NAA及6-BA的不同激素组合进行萌发、增殖及生根培养。通过驯化炼苗,在5-6个月内获得健壮的月季快繁植株。“卡罗拉”腋芽萌发的最适培养基为MS+6-BA 2mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1,萌发率为96.67%;丛生芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA 2mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1,增值系数为3.36;最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.5mg·L-1,生根率可达100%;通过驯化炼苗,盆栽定植的成活率可达90%以上。2.基因枪法瞬时转化月季花瓣的体系优化以“雪山”月季花瓣为受体材料,通过对GUS报告基因的瞬时表达检测,确定了合适转化月季花瓣材料的基因枪轰击条件技术参数,建立了稳定高效的瞬时转化体系。通过试验确定了在相同质粒pCAMBIA1305.1用量0.5μg/枪时的最佳技术参数是轰击压强为1150psi、轰击距离为9cm。3.月季花特异嵌合启动子的构建及对照启动子片段的克隆通过Genebank中已登录的月季查尔酮合成酶CHS基因序列,利用染色体步移法扩增得到CHS基因上游1.3kb的调控序列,通过分析启动子的核心调控元件,克隆包含启动子核心区域RCHS在内的大小为275bp、720bp、1357bp的三组启动子序列作为对照,同时将异源增强子片段OCSenhancer、翻译增强子?元件与CHS花特异启动子RCHS核心片段进行融合,设计合成530bp的单向嵌合启动子序列。4.单向嵌合启动子及对照启动子片段驱动GUS报告基因的植物表达载体的构建及其瞬时表达分析将单向嵌合启动子pOCSenhancer-RCHS-?及三组对照启动子片段R1CHS、R2CHS及RCHS分别替换pCAMBIA 1305.1空载中的CaMV35S启动子,构建CHS启动子片段驱动GUS报告基因的植物表达载体,并根据优化的基因枪技术参数瞬时转化月季花瓣,通过GUS组织化学染色的方法对转基因花瓣进行GUS活性检测。结果表明,275bp的启动子核心片段是驱动GUS基因在花瓣中特异性表达的必要序列,核心区域上游调控序列的延长对于增强GUS基因表达的活性没有显著的影响,但融合增强子序列后的单向嵌合启动子对驱动GUS基因表达水平有明显的提高。以上研究结果验证了月季CHS启动子是花组织特异性表达的启动子,设计并合成的单向嵌合启动子具有增强该组织特异性启动子表达活性的能力,可以提高驱动外源基因在转基因植物中的表达水平,该研究为进一步构建高效的多基因共表达植物载体提供必要的调控元件。