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瘦素(leptin)作为肥胖基因(obesity gene,ob)编码的产物,可通过与瘦素受体(leptin receptor,Lep R)结合来发挥多种生物学功能,尤其是在调节能量稳态方面起着重要作用。本研究探讨了鳜鱼(Siniperca chuatsi)leptin a和leptin b对糖脂代谢的调控作用,解析leptin a和leptin b的功能分化,并为阐明鱼类leptin对代谢调控的作用机制提供资料。实验一,哺乳动物中存在6种leptin受体亚型,而目前仅在少数鱼类中鉴定出多个受体亚型,并发现lepr短型受体在鱼类能量稳态中发挥作用。为了探索鳜鱼lepr是否存在不同的可变剪切亚型,进一步为研究鳜鱼leptin a和leptin b的功能奠定一定基础,我们在鳜鱼基因组数据库基础上,采用c DNA 3’末端快速扩增(Rapid Amplification of c DNA 3’Ends,3’-RACE)技术获得4个不同剪切亚型,包括CDS序列长度为3474 bp的长型受体亚型lepr-L,以及CDS序列长度分别为1512 bp、945 bp和915 bp的短型受体亚型lepr-S1、lepr-S2和lepr-S3,并进行序列分析和进化分析。结果表明,鳜鱼lepr与其他脊椎动物一样,只有长型受体具有完整的重要功能域,包括胞外LBD结合域以及胞内JAK和STAT结合域等,且进化分析表明序列较保守,而短型受体均无跨膜区以及胞内结构。实验二,为了阐明鳜鱼leptin a和leptin b在肝细胞对外源性葡萄糖适应性策略中的调控作用,我们检测了低糖、中糖及高糖(5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L葡萄糖)处理肝脏原代细胞后细胞活性、脂肪含量以及糖代谢的变化,并检测了低糖、中糖及高糖条件下,leptin a和leptin b蛋白对肝细胞糖代谢相关基因表达的影响。结果显示,(1)与低糖组相比,中糖组和高糖组肝细胞的细胞活性和脂肪含量均无显著性差异(P>0.05),且中糖组肝细胞的糖酵解相关基因gk、pfk、pk以及糖异生相关基因pepck和g6pca.1 m RNA的表达水平无显著性变化(P>0.05),而糖原合成酶gs基因水平显著降低(P<0.05);高糖组肝细胞gk基因的表达水平显著增加(P<0.05),g6pca.1基因的表达水平上调但无显著性差异(P>0.05),而pfk、pk、pepck和gs基因的表达水平无显著变化(P>0.05)。结果表明,中糖可能抑制了鳜鱼肝细胞的糖原合成;高糖能够使鳜鱼肝细胞糖酵解加速,同时可能增加了糖异生途径,这可能是鳜鱼不能有效利用高糖物质的原因。(2)与5 mmol/L葡萄糖组相比,5 mmol/L葡萄糖+leptin a和5 mmol/L葡萄糖+leptin b组肝细胞糖酵解相关基因gk和pfk的表达水平显著增加(P<0.05),而糖异生和糖原合成相关基因的表达无明显变化(P>0.05);与15 mmol/L葡萄糖组相比,15mmol/L葡萄糖+leptin a组的gk、pfk、pk和g6pca.1 m RNA的水平显著上调(P<0.05),pepck和gs的表达水平无显著性改变(P>0.05),而15 mmol/L葡萄糖+leptin b组只上调了gk基因的表达水平(P<0.05);与25 mmol/L葡萄糖组相比,25 mmol/L葡萄糖+leptin a和25 mmol/L葡萄糖+leptin b组pfk、pk、pepck、g6pca.1基因的表达均上调。结果表明,鳜鱼leptin a和leptin b均参与肝细胞中糖酵解和糖异生的调控,且leptin a起主要调控作用。实验三,为进一步理解鱼类leptin在脂代谢调控中的作用。我们用不同浓度棕榈酸钠(sodium palmitate,SP)(0、0.1、0.12、0.15、0.2 mmol/L)处理鳜鱼肝脏原代细胞48 h后发现,0.15 mmol/L SP能明显增加肝细胞的细胞活性、甘油三酯及脂肪含量。因此选用0.15 mmol/L SP来诱导肝细胞发生脂肪沉积,模拟肥胖个体的生理状态构建高脂肝细胞,进而检测0.15 mmol/L SP分别与鳜鱼leptin a和leptin b蛋白共同处理肝细胞后脂肪沉积、糖脂代谢以及leptin下游AKT蛋白磷酸化水平的变化,来探索高脂状态下leptin对脂肪代谢的调控作用。结果显示,与0.15 mmol/L SP组相比,leptin a可显著减少高脂肝细胞的脂肪含量(P<0.05),而leptin b对其脂肪含量无显著影响(P>0.05),且leptin a和leptin b能够显著抑制acc1基因的表达(P<0.05),并降低srebp1的表达量但无显著性(P>0.05),同时,leptin a还可上调lepr和hsl基因的表达水平。此外,棕榈酸钠以及鳜鱼leptin蛋白对AKT的磷酸化水平无显著性影响(P>0.05)。结果表明,高脂条件下,leptin a和leptin b均能抑制肝细胞的脂肪合成参与脂质代谢,leptin a还促进了肝细胞的脂肪分解并减少脂质沉积。综上所述,leptin a和leptin b均能促进肝细胞糖酵解和糖异生代谢,且leptin a能够通过抑制脂肪合成并促进脂肪分解来降低脂肪沉积,leptin b能够抑制脂肪合成但对脂肪分解途径和脂肪含量无影响,即leptin a在鳜鱼肝脏糖脂代谢过程中起主要调控作用。本研究结果将为进一步研究鱼类代谢调控网络的分子机制提供资料,并有望为提高鱼类饲料效率提供理论依据。