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癌症是人类健康的最大威胁之一,伴随医学的发展,肿瘤治疗策略已经趋于多样化,有联合治疗、免疫疗法,甚至精准医疗,但在部分肿瘤患者中化疗依旧作为一线治疗方案被使用。如何尽量克服、避免化疗药物因非靶向性带来的毒副作用,一直是临床关注的热点之一。构建靶向递送系统,可提高靶组织局部药物浓度,减少全身毒副作用,实现药物的高效、安全递送,是一种很有前景的给药方法。目前已有两种抗体药物偶联物(Antibody-drug conjugates,ADC)经FDA批准上市且获得良好药效。但在抗体-药物制备过程中的DAR(Drug-anbibody ratio)均一性、裸抗体的免疫原性等问题还未得到良好控制。适配体(Aptamer,Apt)是一种独特的单链寡核苷酸,其功能类似抗体,有着靶分子范围广泛、高特异性及亲和性以及免疫原性低等优势。除可作为药物(例如FDA批准上市的Macugen)单独应用外,更多可作为药物递送系统中的靶向载体。本论文关注化疗药物的靶向递送系统的概念性验证研究,构建适配体-药物偶联物递送系统(Aptamer-drug conjugate,Ap DC),证明其显著提高药物治疗指数,降低药物毒副作用的应用前景。本文首先应用指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),以人的表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3)的胞外结构域(extracellular domain,ECD)为靶目标,筛选获得具有高亲和力和高特异性的候选Apt。选择阿霉素(Doxorubicin,DOX)为递送对象,薄膜分散法制备脂质体阿霉素(liposome-doxorubicin,Lip-DOX)。通过“后插入法”连接Apt,构建稳定的适配体-脂质体-阿霉素(Aptamer-liposome-doxorubicin,Apt-Lip-DOX)。通过包封率、粒径大小、zeta电势、释放度等理化性质指标,考察并优化Apt-Lip-DOX制备工艺。体外实验中,在MCF-7 HER3+、BT474 HER3+细胞及阴性对照293THER3-细胞中考察该Ap DC系统的入胞情况及半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)并对内吞途径进行初步探索。体内实验中,选择MCF-7HER3+荷瘤小鼠模型,考察Ap DC针对其他对照组在靶向性、有效性及安全性方面的优势。第一部分HER3ECD Apt的筛选和鉴定。选择HER3ECD质粒瞬时转染293E细胞,表达回收HER3ECD蛋白,作为筛选的靶蛋白。采用经优化的“QPCR-磁珠分选”SELEX方法,经四轮十次筛选,获得靶向HER3ECD的候选Apt。通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)并拟合亲和力曲线,得出Apt#7及#13亲和力常数较佳,Kd值分别为116±23 n M、98±9.7 n M。通过细胞流式实验及激光共聚焦结果显示,该适配体针对高表达HER3的乳腺癌细胞系具有较高的亲和力及特异性。第二部分Ap DC递送系统的构建及优化。优化脂质体阿霉素的制备工艺,通过DSPE-PEG2000连接Apt,采用“后插入法”制备稳定的Ap DC,即Apt-Lip-DOX。考察Apt-Lip-DOX的理化性质,粒径为170±25 nm,zeta电势为-45.9±6.31 m V,结构稳定。超滤法结合高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定DOX药物包封率为55±5%。模拟体内环境药物释放度结果显示:同等条件下,游离的DOX在1h释放度接近100%,而Apt-Lip-DOX 24h释放度仅为20%,充分证明了该递送系统缓释递送的优势。第三部分Ap DC系统体外胞吞机制和药效实验。细胞水平上,选择MCF-7 HER3+细胞及阴性对照293THER3-,比较Apt的介导是否增加递送系统的入胞量。并通过不同内吞途径抑制剂结合活细胞观测站,初步探讨该Ap DC入胞途径机制。结果表明Ap DC的入胞依赖于HER3的表达及Apt的存在,突出HER3 Apt的优势,同时该Ap DC主要通过网格蛋白介导的内吞作用完成内吞。进一步选择MCF-7 HER3+、BT474HER3+两株细胞系经实时细胞检测(real time cell assay,RTCA)考察DOX不同递送形式的IC50值,同时加入293THER3-细胞作为对照。结果显示,在三株细胞系中,Lip-DOX针对游离DOX的IC50值降低,且均具有统计学差异(P<0.05),体现脂质体递送系统的优势。Apt-Lip-DOX在HER3高表达的MCF-7、BT474中较游离DOX组出现显著性统计学差异(P<0.01),在293T细胞中未表现出该优势。证明所筛选适配体在递送系统中发挥一定的靶向优势,增加体外靶向肿瘤细胞的杀伤力,为后续体内实验奠定基础。第四部分Ap DC系统荷瘤小鼠体内肿瘤靶向性和药效、毒性实验。动物水平上,选择MCF-7荷瘤小鼠,考察体内Ap DC的肿瘤靶向性、有效性及安全性。1)肿瘤靶向性:按照Ap DC制备工艺,选择包裹量子点(QD),制备Apt-Lip-QD,同时Lip-QD为对照组,尾静脉注射MCF-7荷瘤小鼠1h后进行活体成像,观察荧光分布判断药物的体内分布。结果显示Ap DC表现出良好的靶向性,解剖瘤体与Lip-QD相比,具有明显的统计学差异(P<0.01)。2)体内抑制肿瘤药效实验:设置空白对照组(Blank,等体积生理盐水)以及实验组DOX、Lip-DOX、Apt-Lip-DOX共四个组别,实验组的DOX给药量为5mg/kg,每三天尾静脉注射给药。结果显示:给药18天后,Apt-Lip-DOX抑瘤效果针对Blank组具有非常显著的统计学差异(P<0.01,P<0.001),同时较DOX组也表现出较大的优势(P<0.05)。3)体内毒性考察:分别考察小鼠给药期间体重状态,60天存活率,组织病理切片。结果显示:给药期间Apt-Lip-DOX组小鼠状态、体重维持在正常水平,DOX组则在20天出现体重急剧下降的现象。不同组别(DOX、Lip-DOX、Apt-Lip-DOX)小鼠60天以内的存活率分别为0、40%、100%。小鼠死亡后对各脏器做H&E病理切片观察病变损伤情况,在DOX组中,心脏切片显示出现脂肪变性,散在出血点,血管扩张出血等病变;肝脏切片出现局灶肝细胞坏死。在Lip-DOX组中也出现轻微病变,Apt-Lip-DOX组所有组织均正常。综上体内实验结果,充分证明了该Ap DC的靶向性、高效性及安全性。综上,本研究建立并完善SELEX技术路线,为其他靶点筛选提供参考;靶向HER3的治疗策略将会为肿瘤靶向治疗或逆转EGFR抑制剂耐药带来新的思路;以化疗药(DOX)为例,通过构建Ap DC递送系统,对其靶向性、抑瘤作用等进行研究,为实现化疗药的高效低毒递送提供参考。