目的：apelin是近年发现的生物活性肽，通过与它的特异性受体APJ相互作用而发挥重要的生理和病理功能。apelin和APJ均在心血管系统表达,包括血管内皮细胞(endothelial cells, EC)和血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells, VSMC)。apelin可调节血管张力，引起血压下降或阻力血管舒张。体外实验证实，apelin引起血管舒张主要是通过作用于内皮细胞上的APJ受体及促进一氧化氮合酶合成NO来实现的。另有研究表明，apelin也可以直接作用于平滑肌细胞而引起血管收缩，apelin还可通过正性肌力作用提高心肌的收缩力。此外，在EC和VSMC中，apelin是一个强效的血管生成因子和细胞分裂原，apelin及其受体APJ在心血管正常发育中起到非常重要的作用。apelin-APJ系统异常与高血压的发病及其并发症心力衰竭密切相关。在EC、VSMC和心肌细胞中，缺氧和血管生成素I可以诱导apelin表达。然而，在心血管系统中，调节apelin表达的分子机制目前仍知之甚少。Krüppel样因子5（Krüppel-like factor5，KLF5）是一种含有锌指结构的转录因子，是血管紧张素Ⅱ(angiotensin II, Ang II)的靶基因及心血管重塑的重要调节者，KLF5在调节VSMC表型方面也扮演重要的角色。重要的是，KLF5可以与许多其他的转录因子，如c-Jun、维甲酸受体α(retinoicacid receptor α, RARα)、CREB(cAMP-response element binding protein,CREB)结合蛋白(CBP)和PPAR-δ(peroxisome proliferators-activatedreceptor-δ, PPAR-δ)相互作用，共同调节许多基因的表达。另外，血管损伤后KLF5在血管平滑肌细胞中表达上调，在心血管重构过程中激活许多基因，如血小板源性生长因子（platelet-derived growth factorA/B，PDGFA/B）、早期生长反应基因-1(early growth response gene-1, Egr-1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor-1, VEGF)受体等。另外，我们也发现，KLF5可与RARα和HDAC2(histone deacetylase2, HDAC2)在基础条件下形成复合体，结合在p21的启动子上并抑制其表达，而Am80诱导可使KLF5脱乙酰基并且从p21启动子上解离，失去其抑制作用并导致p21启动子的激活。Am80是一种人工合成的维甲酸类似物，是RARα的激动剂，已经在临床上用于治疗急性早幼粒细胞性白血病。RARα属于核受体超家族成员，当与配体，如Am80或全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）结合后，可促进VSMC分化和抑制VSMC增殖。因为血管平滑肌细胞的生物学行为是由转录因子网络和一系列的心血管活性物质调节控制，比如apelin和ATRA等，因此我们预测，促增殖转录因子，如KLF5和Sp1（transcriptionfactor stimulating protein-1, Sp1）和促分化转录因子如RARα，在调控apelin基因表达中存在着相互作用。本研究旨在阐明Am80调节apelin基因表达的分子机制。方法：细胞培养，腺病毒及质粒载体的构建，定点突变，小干扰RNA转染，RNA提取及定量RT-PCR分析，Western印迹分析，荧光素酶报告基因分析，染色质免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull-down分析，GSTpull-down分析，免疫共沉淀分析，BrdU掺入分析，细胞迁移分析，鬼笔环肽细胞骨架染色，免疫组化染色等。结果：1. KLF5和Sp1介导Am80诱导的apelin基因表达KLF5和Sp1在多种细胞的增殖和分化中，都发挥着重要的调控作用。Am80作为RARα的激动剂，可以抑制VSMC的表型转化和增殖，但Am80抑制VSMC表达转化和增殖与KLF5和Sp1之间的关系尚不清楚。在本部分研究中，我们观察KLF5和Sp1在Am80诱导apelin表达中的作用。结果如下：1.1Am80在VSMC中上调apelin基因mRNA和蛋白表达水平基因芯片分析结果表明，在Am80处理的VSMC组中，apelin mRNA表达水平比对照组升高7.48倍。为了验证微阵列分析的结果，我们应用RT-PCR、实时定量PCR及Western印迹分析方法进一步检测apelin在转录和翻译水平的表达情况。结果显示，Am80可显著诱导apelin基因转录和翻译，且呈时间（0、2、6、12、24h）和剂量（0、2、4、8、16μM）依赖性。1.2KLF5通过与apelin启动子上的TCE位点1结合来调节Am80诱导的apelin转录我们利用计算机程序发现，在apelin启动子的-793/-1区域包含3个TCE（transforming growth factor-β control element，TCE）位点。为了检测这3个位点是否对KLF5和Am80应答，我们构建了5’-端连续缺失的apelin启动子报告基因进行荧光素酶报告基因的分析。结果表明，过表达KLF5显著提高apelin的启动子活性，而Am80的诱导可以进一步提高apelin启动子的活性。为了证实这3个TCE位点是否为Am80和KLF5诱导apelin表达所必需，我们突变这3个不同的TCE位点后再进行报告基因分析。荧光素酶活性测定结果表明,突变TCE位点2(-173到-523)和TCE位点3(-523到-793)不影响KLF5对apelin启动子的激活，但突变TCE位点1(-173-1)完全阻断了KLF5对apelin启动子的激活作用。1.3KLF5和Sp1共同调节apelin的表达为了进一步验证KLF5在apelin表达中的重要性，我们分别用腺病毒表达载体pAd-KLF5感染VSMC和应用小干扰RNA（si-KLF5）转染VSMC，以此来过表达和敲低KLF5在VSMC中的表达。结果显示，过表达KLF5显著增加apelin的表达，Am80处理后apelin的转录和翻译进一步增加；相反，敲低KLF5抑制Am80对apelin表达的诱导作用。以上结果说明，KLF5介导Am80诱导的apelin表达。此外，由于Sp/KLF家族成员能够识别相同的CACCC(TCE)或者GC盒元件，因此，我们试图探索Sp1是否也能调节apelin的表达。为了验证这一假说，我们分别应用腺病毒表达载体pAd-Sp1感染VSMC和应用小干扰RNA（si-Sp1）转染VSMC，以此来过表达和敲低Sp1在VSMC中的表达。我们发现，过表达或敲低Sp1对apelin表达的影响与过表达和敲低KLF5的结果是一致的。1.4KLF5和Sp1通过与apelin启动子上的TCE位点1结合介导Am80诱导的apelin表达为了验证Sp1是否也像KLF5那样能够结合在TCE位点1上，我们进行染色质免疫共沉淀分析。结果显示，Am80促进Sp1和KLF5在TCE位点1上的结合；与染色质免疫共沉淀实验结果相一致，寡核苷酸pull-down实验分析也证实KLF5和Sp1结合在TCE位点1上，TCE位点1突变，阻断它们的结合。2. Am80通过促进RARα与KLF5和Sp1相互作用而诱导apelin表达因为Am80通过其特异性受体RARα介导它的生理效应，因此我们试图探索Am80是否通过促进RARα与KLF5和Sp1相互作用来调节apelin表达。在本部分研究中，我们发现KLF5和Sp1通过将RARα募集到apelin启动子的TCE位点1上而协调激活apelin的转录。结果如下：2.1RARα与KLF5和Sp1协同激活apelin启动子的活性为了探明RARα对apelin启动子活性的影响，我们用apelin启动子报告基因及KLF5、Sp1和RARα表达质粒共转染VSMC后进行荧光素酶活性分析。结果显示，单纯过表达KLF5或Sp1或同时过表达两种或三种转录因子，均可增强apelin启动子的转录活性，当同时表达3种转录因子并给予Am80刺激后，apelin启动子的转录活性进一步增强。以上结果表明，RARα和KLF5及Sp1协同激活apelin基因转录。用apelin启动子报告基因及不同转录因子的表达质粒共转染VSMC后进行荧光素酶活性分析。结果显示，共转染等量的Sp1及不同量的KLF5表达质粒后，随着KLF5表达量的增加，Sp1对apelin启动子的转录激活作用逐渐增强。同样，共转染等量的KLF5及不同量的Sp1表达质粒，随着Sp1表达量的增加，apelin启动子的活性亦增强。这些结果表明，KLF5和Sp1协同激活apelin的转录。2.2Am80促进RARα与KLF5-Sp1复合物结合因为RARα与KLF5和Sp1协同激活apelin启动子的活性，所以我们通过免疫共沉淀和GST pull-down实验检测它们三者之间是否存在相互作用。结果显示，在未给予Am80刺激的VSMC中, RARα与KLF5和Sp1可以在一定程度上结合，给予Am80刺激后，RARα与KLF5-Sp1复合物结合活性增强。2.3Am80促进RARα-KLF5-Sp1复合物结合在apelin启动子的TCE位点1上由于KLF5、Sp1和RARα三者之间形成复合物，我们探索Am80是否促进该复合物在apelin启动子上的募集。连续ChIP实验分析显示，用KLF5抗体先沉淀VSMC的染色质片段可以扩增得到含有TCE位点1的DNA片段，Am80处理使KLF5与DNA的结合显著增加。然后，用Sp1或RARα抗体再次沉淀KLF5抗体沉淀得到的染色质片段，二次沉淀物中仍能扩增得到含apelin启动子TCE位点1的DNA片段。以上结果表明，RARα、KLF5和Sp1在apelin启动子的TCE位点1上形成复合物，Am80刺激促进三者在apelin启动子上的募集装配。按相同的方法，我们首先用Sp1抗体沉淀VSMC染色质片段,然后再用KLF5或RARα抗体沉淀Sp1抗体沉淀得到的染色质片段，二次沉淀物中也能扩增得到含有apelin启动子的TCE-位点1的DNA片段，所得到的结果与以上结果相一致。为了进一步研究RARα在apelin启动子上的募集是否依赖于KLF5-Sp1复合物在apelin启动子TCE位点1的结合，我们应用小干扰RNA技术分别敲低内源性KLF5和Sp1后，应用ChIP分析检测RARα在apelin启动子上的结合情况。结果显示，应用si-RNA技术敲低内源性KLF5和Sp1可显著抑制RARα在apelin启动子上的募集。另外，我们应用si-RNA技术敲低内源性RARα后进行ChIP分析的结果也表明，Am80刺激明显促进KLF5和Sp1在apelin启动子TCE位点1上的结合；应用si-RARα下调内源性RARα表达可减少Am80诱导的KLF5和Sp1在apelin启动子上的募集。以上结果表明，RARα结合在KLF5-Sp1复合物上，以RARE非依赖的方式调节apelin基因的转录。3. apelin促进VSMC表型转化和增殖已经证明VSMC的增殖和迁移受到许多因素的调控，但apelin对VSMC表型的调节仍然知道的很少。因此，在本部分研究中，我们探索apelin和Am80在调节VSMC表型中的关系。3.1apelin-13促进VSMC的增殖和迁移BrdU掺入分析实验结果显示，apelin-13以浓度（0、0.02、0.05、0.1、1μM）和时间（0、2、6、12、24h）依赖的方式促进VSMC的增殖。通过伤口愈合实验分析，我们观察apelin-13对VSMC平面迁移能力的影响。结果显示，apelin-13可显著增强VSMC的迁移能力；western印迹结果显示，与迁移密切相关的基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）表达也明显升高。同时，我们通过免疫印迹实验发现，apelin-13可以以浓度（0、0.02、0.05、0.1、1μM）和时间（0、2、6、12、24h）依赖的方式促进增殖标志基因PCNA和cyclinD1表达；而分化标志基因SM α-actin的表达明显减少。鬼笔环肽染色显示，apelin-13处理的VSMC中肌丝明显减少；Am80处理明显使VSMC形态伸长，形成许多粗大的、沿细胞长轴平行排列的应力纤维。这些结果提示，apelin-13促进VSMC向增殖表型转化。3.2apelin拮抗Am80诱导的VSMC分化为进一步研究apelin对VSMC表型的影响，我们应用si-RNA技术敲低内源性apelin后再用Am80处理细胞。免疫印迹实验结果显示，敲低内源性apelin后再用Am80处理的VSMC与未敲低apelin直接用Am80处理的细胞相比，SM22α的表达升高而PCNA的表达水平降低。同时，鬼笔环肽染色显示，敲低内源性apelin后再用Am80处理的VSMC伸长更加明显，并形成更多的沿细胞长轴平行排列的应力纤维。结果提示，apelin可以在一定程度上拮抗Am80诱导的VSMC分化。3.3敲低apelin抑制球囊损伤诱导的血管新生内膜的增生利用大鼠颈总动脉球囊损伤模型，我们观察敲低apelin后对血管新生内膜形成的影响。HE染色结果显示，损伤14天后，与模型组相比，apelin敲低动物的血管内膜/中膜（I/M）比值明显降低。免疫组织化学染色结果显示，apelin敲低动物的血管新生内膜和中膜中PCNA的表达明显减少。结果表明，apelin可促进血管新生内膜的形成。结论：1. Am80上调apelin基因mRNA和蛋白表达水平。2. KLF5和Sp1与apelin启动子上的TCE位点1结合来调节Am80诱导的apelin转录。3. Am80通过促进RARα与KLF5和Sp1相互作用诱导apelin表达。4. apelin促进VSMC表型转化和增殖。5. apelin促进血管新生内膜的形成。