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在水产养殖中由于抗微生物药物的滥用造成耐药病原大量出现、养殖环境不断恶化、水产品药物残留量超标等一系列问题。因而,抗生素替代品的研发受到了广泛的关注。现在,许多关于益生菌的研究报道表明其在水产养殖中不仅在一定程度上可以替代抗生素,还可以发挥许多益生作用,例如,促进鱼类生长、提高饵料效率、改善肠道菌群、增强免疫力、拮抗病原及改善水质等等。因此,安全、有效的益生菌株的筛选及应用对于水产养殖业的可持续发展至关重要。本论文通过体外实验研究了环境分离菌株及消化道分离菌株的益生特性(胞外酶产生谱、病原菌拮抗谱)及其对胃肠道内环境的耐受力,同时依据体外实验结果选取分离株Bacillus G024 (分离自水体环境)、Bacillus M001(分离自牙鲆消化道)进行体内实验,研究了其对实验动物大菱鲆的生长、免疫、抗病力、肠道菌群结构的影响。1.海洋源产胞外酶细菌的分离鉴定本研究从牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(S. maximus)、点带石斑鱼(E.coioides)、斑鰶(Konosirus punctatus)消化道及海参露天养殖池的海水和底泥中分离细菌,分别用脱脂乳2216E琼脂平板(含脱脂乳1%)、马铃薯淀粉2216E琼脂平板(含马铃薯淀粉0.3%)、羧甲基纤维素钠2216E琼脂平板(含羧甲基纤维素钠1%)、TW-802216E琼脂平板(含TW-800.8%)筛选产胞外酶菌株,获得98株胞外酶产生细菌,其中革兰氏阳性菌44株、革兰氏阴性菌54株。进一步对菌落形态差异较大、产酶谱广、酶活高的16株细菌进行16S rRNA基因序列鉴定分析,BLAST比对结果表明上述菌株分别属于乳酸乳球菌(Lactococcus) (A005)、芽孢杆菌(Bacillus)(B005. G012、G024、K003、M001、N004、P008、Y005)、库克氏菌(Kocuria) (C005)假交替单胞菌(Pseudoalteromonas) (G002、W003)、弧菌[Vibrio) (H002、P010)、利斯顿氏菌(Listonella) (H012)、杀藻菌(Microbulbifer) (J003)。对上述菌株进行水产常用药物(呋喃唑酮、四环素、利福平、氨苄西林、丙氟哌酸、氯霉素)的耐药性检测,结果表明G002、H012、P010都对氨苄西林有不同程度的耐药性。2.产胞外酶芽孢杆菌对水产病原菌拮抗效果的评价平板扩散法测定产胞外酶芽孢杆菌(Bacillus)B005、G012、G024、K003、M001、K N004、P008、Y005的无菌培养上清抑制12株指示菌(Edwardsiella tarda. LSE40、 Streptococcus sp. CF、Staphyloccocus aureus.B. cereus、V. anguillarum M3、V. campbellii 1.1596、V.fluvialis 1.1608、V. harveyi 1.1593. F. vulnificus L32、V. parahamolyticus 1.1587、V. alginolyticus 1.1607、V. splendidus 1.1604)所形成的抑菌直径；利用扫描电子显微镜观察G024、N004无菌培养上清对指示菌结构的影响。实验结果表明除G012、Y005外,其余6株产酶菌株均不同程度的对指示菌产生了拮抗作用；扫描电子显微镜观察结果表明G024、N004均对指示菌表层结构发挥了破坏作用。3.潜在益生芽孢杆菌的生长特性、消化道内环境耐受力及动物安全性研究测试芽孢杆菌B005、G012、G024、K003、M001、N004、P008、Y005在相对比较宽泛的温度范围(10-40℃)、pH值范围(6-8)、NaCl浓度范围(0.5-12.5%)内均能生长,且多数菌株的对数生长期为6 h。菌株B005、G012、G024、K003、Y005在相对较高牛胆盐浓度(0.015%,w/v)下可以生长；同时,菌株G012、G024、K003、M001对人工胃液(0.1% pepsin、0.9% NaCl、pH4)具有相对更强的耐受力(3 h内数量仅降低2-3数量级)；此外,菌株B005、G024形成生物被膜能力较强(P<0.05)。8株测试芽孢杆菌的大菱鲆(S. maximus)血细胞溶血活性皆为阳性、卵磷脂酶活性皆为阴性,不携带质粒。动物安全性试验结果显示所有菌株对大菱鲆没有致病性。4.潜在益生芽孢杆菌G024和M001对大菱鲆生长、消化酶活力、天然免疫水平、消化道菌群结构及抗病力的影响潜在益生芽孢杆菌G024、M001与饵料混合,制备成含菌量为5.0×108 CFU/g。进行为期42天的投喂养殖试验。对实验鱼的体重、特定生长率、饵料系数进行测定,结果显示投喂组和对照组没有显著差异(P>0.05)。对大菱鲆肠道消化酶进行检测,结果显示G024处理组的肝胰脏脂肪酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胃淀粉酶皆显著高于对照组(P<0.05)；M001处理组的肝胰脏蛋白酶、肝胰脏脂肪酶显著高于对照组(P<0.05)。对血清非特异性免疫学指标进行检测,结果显示G024处理组血清溶菌酶显著高于对照组(P<0.05)；M001处理组超氧化物歧化酶、血清总蛋白含量皆显著高于对照组(P<0.05)。但血清一氧化氮合成酶活力、血清酸性磷酸酶活力、血清碱性磷酸酶活力均无显著变化。用浓度为4.8×104 CFU/mL的致病性鳗弧菌M3 (V. anguillarum)以肌肉注射途径攻毒大菱鲆,结果显示投喂细菌组大菱鲆的累计死亡率分别为10.67±2.31%(G024处理组)、33.33±12.86%(M001处理组)皆显著低于对照组累计死亡率(89±8.33%)(P<0.05)。利用PCR-DGGE技术对肠道菌群样本进行分析,结果表明,对照组中的优势条带14 (Rubritalea spongiae strain YM21-132),15 (Janibacter anophelis strain CCUG 49715)、I6(Uncultured bacterium)、 17 (Uncultured bacterium)在处理组中出现不同程度的消失,且对照组的条带数量和香浓指数均高于处理组,但差异不显著(P>0.05)。以上结果充分表明G024、M001能提高大菱鲆消化道酶活,调节肠道菌群,增强抗病力,可作为潜在益生菌。